angol-magyar
kétnyelvű tudományos folyóirat
HUN / ENG

Toxikológia, élelmiszer-biztonság


Közeli-infravörös spektroszkópia: gyors és hatékony eszköz a fruktóztartalom mérésére

Cikk letöltése PDF formátumban

Közeli-infravörös spektroszkópia: gyors és hatékony eszköz a fruktóztartalom mérésére

DOI: https://doi.org/10.52091/EVIK-2021/1-1-HUN

Érkezett: 2020. október – Elfogadva: 2021. január

Szerzők

1 Élettani és Állategészségügyi Tanszék, Élettani és Takarmányozási Intézet, Magyar Agrár- és Élettudományi Egyetem,
2 Élelmiszeripari Méréstechnika és Automatizálás Tanszék, Élelmiszertudományi és Technológiai Intézet, Magyar Agrárés Élettudományi Egyetem
3 Adexgo Kft., Balatonfüred
* Levelező szerző: bazar@agrilab.hu

Kulcsszavak

Fruktóz (gyümölcscukor), cukrok, °Brix, NIR-spektroszkópia (közeli-infravörös), fruktóz kedvezőtlen élettani hatása, anyagcsere-rendellenessége, szív-és érrendszeri betegségek, spektrum előkezelése, vegyértékrezgés, felharmonikus rezgés, statisztikai spektrum-elemzés

1. Összefoglalás

A legújabb kutatások alapján a magas fruktózbevitel fokozott egészségügyi kockázatokkal jár, ezért fontos felhívni a figyelmet az élelmiszerekben és italokban széles körben felhasznált cukor mennyiségére. A különböző cukrok gyors és pontos kimutatása és mennyiségi meghatározása a hagyományos laboratóriumi technológiák alkalmazásával nem egyszerű feladat. Számos korábbi kutatás eredménye utal arra, hogy a közeli-infravörös (NIR – Near Infra Red) spektroszkópia hatékonyan alkalmazható a cukrok minőségi és mennyiségi analízise során. Jelen vizsgálatunk rávilágít ennek a gyors korrelatív analitikai technikának az alkalmazhatóságára a fruktózkoncentráció cukoroldatokban történő mérése terén, amennyiben a bemutatott NIR kalibrációk megbízhatók a °Brix mint relatív paraméter mérésekor (R2 = 0,84), valamint az egyes cukrok közvetlen meghatározásakor (R2 > 0,90), még vegyes összetételű oldatokban is.

2. Bevezetés

Az édesítőszerek a feldolgozóipar legszélesebb körben alkalmazott adalékanyagaivá váltak, különösen italok és egyéb termékek, például desszertek vagy joghurtok előállítása során. Az egyik legrégebbi édesítőszer, amit a történelemben dokumentáltak, a méz [1], amely a néhány évtizede szintén hagyományos édesítőszerként fogyasztott egyéb édesítőkhöz hasonlóan, mint a juharszirup, szentjánoskenyér és agave, nagyrészt glükózt, fruktózt, szacharózt, ásványi anyagokat és egyéb vegyületeket tartalmaz [1]. A glükóz szinte mindig jelen van az élelmiszerekben, és alapvető szerepet tölt be az emberi anyagcsere szabályozásában. A szervezetbe juthat szabad cukor formában (glükóz por) vagy polimerekben kötötten mint keményítő, dextrin és maltodextrinek. A glükóz diszacharidokban is előfordul, a leggyakrabban haszált cukor, a szacharóz vagy répacukor például glükózból és fruktózból áll [2].

A fogyasztók egészségére gyakorolt hatásuk okán az élelmiszeriparban használt édesítőszerek formájával és mennyiségével, valamint a feldolgozott élelmiszerek °Brix-értékével kapcsolatban már egy ideje aggályok merültek fel. Ennek oka elsősorban az anyagcsere-rendellenességek (pl. 2-es típusú cukorbetegség) kialakulásának kockázata, amelyet a magas cukor-, különösen a fruktóz bevitelével hoznak összefüggésbe. A fogyasztók egyre inkább tudatában vannak annak, hogy mit fogyasztanak, és e tudatosság első lépése, hogy a feldolgozott élelmiszerek kalóriatartalmának csökkentését részesítik előnyben, csökkentve a cukorbevitelt is [3].

Megállapították, hogy a nagy glükóz bevitelhez képest a nagy fruktóz bevitel anyagcserezavar [4], elhízás, cukorbetegség, valamint a vér triglicerid koncentrációjának és az inzulin rezisztencia növekedésének magasabb kockázatával jár [5, 6, 7]. A szív- és érrendszeri betegségek, sőt a test szöveteiben előforduló rosszindulatú daganatok magas kockázata összefüggésben lehet a túlzott fruktóz bevitellel [8], valamint a dyslipidaemiával (a vér kóros lipidtartalmával) és a vesebetegségekkel [9].

Az évek során a közeli-infravörös (NIR) spektroszkópia alkalmazása az édesítőszerekben lévő cukrok elemzésére könnyebbnek, gyorsabbnak és költséghatékonyabbnak bizonyult [10], mint a nagyműszeres gyakorlatot igénylő és reagenseket igénylő módszerek, például a gázkromatográfia (GC), a nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia (HPLC) és enzimatikus analízis [11, 12]. Mind közül a HPLC a leggyakrabban alkalmazott módszer, amelyet a szabad fruktóz-, glükóz-, szacharóz-, maltóz- és laktóztartalom meghatározására használnak [13].

A NIR spektrális régió 800 és 2500 nm (12500-4000 cm-1) közötti hullámhossztartományban található a felharmónikus és kombinációs molekularezgéseket reprezentáló abszorpciókkal, amelyek a –CH, –OH, –NH és – SH funkciós csoportoknak tulajdoníthatók [14]. Glükóz esetében az O–H vegyértékrezgés első felharmónikusa az 1195, 1385, 1520, 1590, 1730 nm abszorpciós sávoknak felel meg, míg a fruktóz és szacharóz O–H vegyértékrezgés első felharmónikusa 1433 nm-re, és a szacharóz, glükóz, fruktóz O–H kombinációs sávja 1928 nm-re tehető [14].

A mono- és diszacharidokat, mint a glükózt, a fruktózt, a szacharózt, a laktózt vizes oldatokban is vizsgálták [15]. Noha az összes érintett cukor azonos moláris koncentrációban volt feloldva, tényleges tömegük jelentősen különbözött a mono- és diszacharidok molekulatömegének különbsége miatt. A keverékekben lévő cukrok mennyiségi meghatározásakor a cukoroldatok moláris koncentrációja kevésbé pontos kalibrációs modelleket adott, a térfogatra vonatkoztatott tömegkoncentrációra illesztett kalibrációs modellekhez képest. Mivel a spektrális információ leginkább a kémiai kötések gerjesztés során bekövetkező fényelnyelését jelenti, ez az információ szorosabb arányban áll a vizes oldatban lévő kémiai kötések és atomok számával, mint a molekulák számával. Az egyes cukrok kalibrációs modelljeinek regressziós vektorai megadták azokat a spektrális régiókat is, amelyek a cukrok kvantitatív elemzésében a legnagyobb jelentőséggel bírnak. Az 1100- 1800 nm hullámhossztartományban a regressziós vektorok elemzése meghatározta a víz és az oldott cukrok O–H és C–H kötéseire jellemző spektrális régiókat. A keverékekben lévő cukrok koncentrációjára illesztett kalibrációk még alacsony szinteken (0,0018-0,5243 g/cm3) is pontos validációs eredményt mutattak, a determinációs együtthatók (R2CV) 0,841 és 0,961, a standard hiba (SECV – Standard Error of Cross-Validation) értékek 0,024 g/cm3 és 0,012 g/cm3 voltak glükóz és fruktóz esetében. Mindez megmutatta egy adott cukor NIR spektroszkópiára alapozott mennyiségi meghatározásának lehetőségét vegyes oldatokban [15].

Hasonló tanulmányokban [10, 16, 17] glükóz, fruktóz és szacharóz mennyiségét határozták meg különböző gyümölcslevekben NIR technika segítségével. A részleges legkisebb négyzetek regressziós (PLSR) modellek pontosnak bizonyultak glükóz, fruktóz és szacharóz esetében (R2 > 0,854; 0,963; 0,953). Egy másik kutatásban szintén megbízható PLSR (Partial Least Squares Regression) modellekről számoltak be a 900-2000 nm hullámhossztartományban [18], míg a 900-1650 nm-es tartomány jónak bizonyult bio cukor és hagyományos barnacukor megkülönböztetésére a részleges legkisebb négyzetek diszkriminanciaanalízis (PLS-DA – Partial Least-Squares Discriminant Analysis) modellek segítségével [19]. Egy másik kutatásban a NIR technika alkalmazásával a glükózkoncentrációt határozták meg glükóz, albumin és foszfát vizes keverékében, és pontos PLSR modellekről számoltak be [20]. Hasonlóképpen beszámoltak Morindae officinalis kivonatok glükóz-, fruktóz- és szacharóztartalmának NIR-rel történő becslésének lehetőségéről [21].

A magyar élelmiszeripart számos élelmiszerelőállításra szánt édesítőszer árasztja el. Három kiemelt édesítőszer a D-szacharóz, a K-syrup LDX és a K-sweet F55, utóbbi kettő általánosan használt izocukor. A K-syrup LDX édes, viszkózus, gyorsan kristályosodó szirup, amelyet gyakran használnak fermentációs alapanyagként az élelmiszer- és gyógyszeriparban. Nagy mennyiségben tartalmaz glükózt, dextrózt (93%), kisebb mennyiségben fruktózt (0,5%) és viszkózus folyadékot [22]. A K-sweet azonban magas kalóriatartalmú, glükózból és fruktózból álló izocukor, amiben a fruktóztartalom nagyobb (55%), mint a glükóztartalom (45%) [23]. A harmadik édesítőszer a D-szacharóz, vagy finomított cukor, amit egyre inkább helyettesítenek K-syrup LDX-szel és K-sweet F55-tel.

Jelen kutatásban a NIR spektroszkópia alkalmazhatóságának feltárását tűztük ki célul a széles körben használt D-szacharóz, K-syrup LDX és K-sweet F55 édesítőszerek vizes oldatainak glükóz-, fruktóz-, szacharóztartalmának és °Brix értékének meghatározása terén.

3. Anyagok és módszerek

3.1. Mintaelőkészítés

A vizsgálatok során háromféle cukrot használtunk: D-szacharóz (Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Németország): 100% szacharóz; K-Syrup LDX (KALL Ingredients Kft., Tiszapüspöki, Magyarország): 93% glükóz + 0,5% fruktóz + 6,5% víz; K-Sweet F55 (KALL Ingredients Kft., Tiszapüspöki, Magyarország): 45% glükóz + 55% fruktóz. A három cukor vizes oldatait tíz különböző koncentrációban készítettük el. Összesen 30 db, egyenként 100 ml térfogatú mintát készítettünk.

3.2. Laboratóriumi mérés

A °Brix értékeket Hanna HI96801 digitális refraktométerrel mértük és rögzítettük referenciaként az ezt követő NIRS kalibrációhoz. Az egyes cukoroldatok glükóz-, fruktóz- és szacharózkoncentrációját az oldatokhoz adott édesítőszer tömege és az édesítőszerekben lévő cukrok százalékos aránya alapján számítottuk ki. A következő összefüggéseket alkalmaztuk a glükóz- és fruktóztartalom kiszámításához a K-syrup LDX és K-sweet F55 oldatokon:

  1. Glükóz K-syrup LDX oldatban = 93/100* K-syrup mennyisége oldatban (g/100 g)
  2. Fruktóz K-syrup LDX oldatban = 0,5/100* K-syrup mennyisége oldatban (g/100 g)
  3. Glükóz K-Sweet F55 oldatban = 45/100* K-sweet F55 mennyisége oldatban (g/100 g)
  4. Fruktóz K-sweet F55 oldatban = 55/100* K-sweet F55 mennyisége oldatban (g/100 g)

A 30 minta mért °Brix értékét, valamint az összes cukor-, a glükóz-, a fruktóz-, és a szacharózkoncentrációkat az 1. táblázat foglalja össze.

1. táblázat. A vizsgálathoz használt vizes cukoroldatok összes cukor-, glükóz-, fruktóz- és szacharózkoncentrációja és °Brix értéke

D-szacharóz: 100% szacharóz; K-syrup LDX: 93% glükóz+0.5% fruktóz; K-sweet F55: 45% glükóz+ 55% fruktóz; SD: szórás; Max: maximum érték; Min: minimum érték

3.3. NIR spektroszkópiás mérés

A minták közeli-infravörös fényelnyelését szobahőmérsékleten (25 °C) FOSS NIRSystems 6500 spektrométerrel (FOSS NIRSystems, Inc, Laurel, MD, USA) mértük, amit a WinISI v1.5 szoftverrel (InfraSoft International, Port Matilda, PS, USA) működtettünk. A szkennelést transzmissziós módban végeztük, miután 1 ml térfogatú cukoroldatot 1 mm úthosszt biztosító kvarc küvettába töltöttük. Az egyes mintákból két mérési kört végeztük véletlen sorrendben, és mindig a soron következő mintát használtuk a küvetta háromszoros kimosására a szkennelések között. Összesen hatvan spektumot rögzítettünk, majd a két kör spektrumait átlagoltuk, így harminc spektrumot kaptunk.

3.4. Spektrum előkezelés és többváltozós statisztikai elemzés

A NIR adatok elemzéséhez az Unscrambler v9.7 szoftvert (CAMO Software AS, Oslo, Norvégia) használtuk, míg a °Brix, a glükóz-, a fruktóz- és a szacharózkoncentrációra mért és kalibrált változók leíró statisztikájának kiszámításához a MS Excel 2013 programot használtuk.

A spektrumok szórásának korrekciójához, valamint pontos és robusztus kalibrációs modellek eléréséhez több spektrum előkezelési eljárást is alkalmaztunk, mint a standard normális változó transzformáció (Standard Normal Variate – SNV), a többszörös szóródási korrekció (Multicative Scatter Correction – MSC) és a résszegmens második derivált (másodrendű derivált, 5 adatpontos rés, 5 adatpontos szegmens).

Mind a különböző édesítőszerekből készült oldatok csoportosítását, mind a kérdéses kvantitatív paraméterek kalibrációját többváltozós adatelemzéssel végeztük. Főkomponens elemzést (Principal Component Analysis – PCA) alkalmaztunk a spektrális adatok többdimenziós mintázatainak vizsgálatára, és a cukoroldatok három csoportja közötti különbségek leírására [24]. A NIR tartományban (1100-1850 nm) felvett a spektrális adatokra és a referenciaként használt laboratóriumi eredményekre a parciális legkisebb négyzetek regressziójával (PLSR) kalibrációs modelleket készítettünk [24]. A PLSR modellezés során a látens változók optimális számát teljes keresztvalidációval (“leave-one-out”) határoztuk meg, ekkor a harminc lépéses iteratív folyamatban a harminc minta mindegyikét egyszer kihagytuk a kalibrálás során, és a modellek validációja során használtuk fel [24].

A PLSR modellek minősítését a kalibrációs és a keresztvalidációs statisztikák összehasonlításával végeztük el. A különböző modelleket a kalibrációk (C) és validációk (CV) determinációs együtthatóinak (R2) és legkisebb négyzetes eltérés értékeinek (RMSE) összevetése alapján ítéltük meg: a nagyobb R2 érték és a kisebb RMSE érték (Root Mean Square Error) jelentette a jobb modellt. A modelloptimálás során az RMSECV (Root Mean Square Error of Cross Validation) értékeket minimalizáltuk.

4. Eredmények és értékelésük

A felvett nyers spektrumok a víz jellegzetes abszorpcióját mutatták a NIR tartományban, amelynek fő csúcsa az O–H vegyértékrezgés első felharmonikus tartományába esik 1450 nm-nél (1. ábra). Az 1780 nm körüli kis csúcs a C–H kötések első felharmonikusát jelöli.

1. ábra. A vizsgált cukoroldatok nyers spektrumai az 1100-1850 nm hullámhossztartományban

A második derivált spektrumokat a rés-szegmens transzformáció derivált függvényével számítottuk, a rést és a szegmenst egyaránt 5 adatpontra állítottuk, hogy elkerüljük a derivált függvény zajnövelését, ugyanakkor a hasznos jeleket továbbra is az előkezelt adatokban tartsuk. A második derivált spektrum (2. ábra) negatív csúcsai jelzik az eredetileg átfedő abszorpciók helyét és relatív amplitúdóját, amelyek egyként jelennek meg a nyers spektrumokon. Ez mutatja azt a jól leírt jelenséget, miszerint a nyers spektrumon 1450 nm-nél elhelyezkedő fő csúcsot a víz legalább két abszorpciója alkotja 1416 és 1460 nm-nél, amelyek a víz hidrogénkötéssel kevésbé és jobban kötött állapotainak elnyélési tartományai [15].

Az itt alkalmazott spektrális előkezelések (második derivált, SNV, MSC) nem tették lehetővé a különböző édesítőszerekkel készült oldatok vizuális megkülönböztetését, míg a vízabszorpciós csúcsok fokozatos változásai jelezték az oldott cukrok növekvő koncentrációjának a víz szerkezetére gyakorolt hatását [15].

A 3. ábra a harminc oldat második derivált spektruma alapján készült PCA háromdimenziós score diagramját mutatja. A háromféle édesítőszer oldatát különböző színekkel és számokkal jelöltük. A két ábra különböző szögekből mutatja ugyanazt az eredményt, kiemelve, hogy a negyedik főkomponens (PC4) felelős a K-sweet F55 megkülönböztetéséért a D-szacharóztól és a K-syrp LDX-től, míg a második főkomponens (PC2) felelős a D-szacharóz elkülönítéséért a K-syrp LDX-től és a K-sweet F55-től. Tehát a PC2, a kiindulási NIR adatok varianciájának mintegy 2%-át kitevő új látens változó, írja le a monoszacharid és diszacharid oldatok közötti különbségeket, míg a PC4, ami a kiindulási NIR adatok varianciájának kevesebb, mint 1%-át fedi le, írja le a magas fruktóztartalmú szirup és más édesítőszer oldatok közötti különbségeket. A PC2 és PC4 kombinációja leírja a glükóz- és más oldatok közötti különbségeket.

2. ábra. A vizsgált cukoroldatok második derivált spektrumai az 1100-1850 nm hullámhossztartományban
3. ábra. A háromféle cukoroldat második derivált spektrumai alapján készült főkomponens elemzés (PCA) score értékei (a) az első (PC1), második (PC2) és negyedik (PC4) főkomponens, illetve (b) a PC1, PC4 és PC2 által meghatározott háromdimenziós térben. A piros (1), zöld (2) és világoskék (3) pontok egyenként jelölik a D-szacharózt, a K-Syrup LDX-et és a K-Sweet F55-öt.

A 4. ábra szemlélteti a PC2 és PC4 loading vektorokat. Azok a hullámhossztartományok felelősek leginkább a főkomponensek score értékeiért, amelyek a legnagyobb eltérést mutatják a nullához képest, vagyis a hozzárendelt csúcsok jelölik a cukoroldatok közötti különbséget előidéző abszorpciókat. A sávok beosztása jó összhangban van korábbi megállapításokkal [14,15], vagyis az 1300-1600 nm-es intervallumban lévő csúcsok a víz oldott cukrok hatására bekövetkező molekuláris változásaira utalnak, míg az 1600-1850 nm-es intervallum csúcsai a jellemző C–H abszorpciós sávokat jelölik.

A mért °Brix és a számított glükóz-, fruktóz-, szacharózkoncentráció alapján PLS regresszióval épített kalibrációs modelleket a 2. táblázat és az 5. ábra foglalja össze.

4. ábra. A PC2 (kék) és PC4 (piros) loading vektorok, amelyek egyenként mutatják a felelős abszorpciós sávokat a D-szacharóz elkülönülésében a K-Syrup LDX-től és a K-Sweet F55-től, valamint a K-Sweet F55 elkülönülésében a D-szacharóztól és a K-Syrup LDX-től.
2. táblázat. A kalibrációs és validációs statisztikák a °Brix, a glükóz-, a fruktóz- és a szacharózkoncentrációra cukoroldatokban (n = 30) a legjobb modellek kiemelésével

LV: látens változók száma, R2C: kalibráció determinációs együtthatója, RMSEC: kalibráció átlagos négyzetes eltérése, R2CV: keresztvalidáció determinációs együtthatója, RMSECV: keresztvalidáció átlagos négyzetes eltérése, MSC: többszörös szóródási korrekció, SNV: standard normális változó, 2D5G5S: másodrendű derivált 5 pontos réssel és 5 pontos szegmenssel

A °Brix esetében a legjobb eredményeket spektrális előkezelés nélkül értük el. A °Brix RMSE értéke 1 °Brix körül volt, ami a mért referenciaérték szórásának majdnem harmada. A cukorkoncentrációk RMSE értékei hasonlóan alacsonyak voltak. A fruktózra kaptuk a leggyengébb eredményeket, melynek oka a számos alacsony koncentrációjú minta (0,05% alatt) – ezen a szinten a modell gyengébben teljesített, mint a nagyobb koncentrációknál (5. (b) ábra). A glükóz és szacharóz esetében a második derivált előkezelés, míg a fruktóz esetében a kezeletlen spektrum adta a legjobb eredményeket.

A legjobb °Brix, fruktóz, glükóz és szacharóz modellek kalibrációs és keresztvalidációs egyeneseit az 5. ábra mutatja. A fekete átló az optimális, míg a kék és a piros egyenesek a kalibrációs és keresztvalidációs illeszkedést mutatják. A kék pontok a NIR által becsült összetételi értékeket jelölik a laboratóriumi referenciaértékek függvényében a kalibráció során, a piros pontok pedig a NIR által a keresztvalidáció során becsült értékeket mutatják szintén a referenciaértékek függvényében. Minél közelebb helyezkednek el a pontok a regressziós egyeneshez, és minél kevésbé tér el a regressziós egyenes az optimális illeszkedéstől, annál jobb a kalibrációs modell. Az esetek többségében a kapott modellillesztések elérik az optimálisat, ami azt jelenti, hogy a NIR által becsült értékek közel megegyeznek a tényleges laboratóriumi referenciaértékekkel. Ennek a kutatásnak a kalibrációs és keresztvalidációs eredményei összhangban vannak a korábban említett, cukoroldatok és gyümölcslevek esetében kapott eredményekkel. Ezek az eredmények igazolják, hogy megfelelő kalibrációs folyamat után a NIR spektroszkópia megfelelő és hatékony eszköz egyes egyszerű cukrok gyors, egyszerű és pontos mérésére keverék oldatokban.

5. ábra: Optimális modellillesztés (fekete átló), valamint a legjobb kalibrációs (kék) és keresztvalidációs (piros) (a) °Brix, (b) fruktóz-, (c) glükóz- és (d) szacharózkoncentráció illesztés

5. Következtetések, záró gondolatok

A széles körben használt édesítőszerekkel kapcsolatos kutatásunk eredményei megerősítik azokat a korábban publikált eredményeinket, miszerint a NIR spekstroszkópia hasznos és hatékony módszer egyes cukrok kimutatására és mennyiségi meghatározására akár vegyes oldatokban is. A NIR spektrométerek ma már nem csupán a hordozható méretben, de akár néhány centiméteres chipként is elérhetők, így jelentős potenciál rejlik ebben a technikában a mindennapi élelmiszerminősítés terén. Az alkalmazások széles körét kell tesztelni és használni a termékek ellenőrzésére, így garantálva az élelmiszerbiztonságot és a beltartalmi összetételt. Ezen alkalmazások közül az ételek és italok fruktóztartalmának ellenőrzése és igazolása hasznos lehet a fogyasztók egészségének védelme szempontjából, mivel ez az összetevő bizonyítottan növeli több modern kori betegség kialakulásának kockázatát. A NIR spektroszkópia mint másodlagos korrelatív analitikai technika feltételezhetően a jövőben is alkalmatlan lesz arra, hogy segítségével egy teljesen ismeretlen összetételű folyadékban kimutassuk a fruktózt és meghatározzuk annak mennyiségét, viszont alkalmas lehet arra, hogy egy ismert, fruktózt nem, vagy csak meghatározott mennyiségben tartalmazó folyadékban jelezze annak túlzott jelenlétét. A NIR eszközök felhasználhatósága természetesen korlátozott, és nem tekinthetünk rájuk úgy, mint a klasszikus analitikai módszerek kiváltóira, azonban a lehetőségek racionális kihasználása révén hasznos alkalmazások fejleszthetőek a gyakorlat számára.

6. Irodalom

[1] Edwards, C. H., Rossi, M., Corpe, C. P., Butterworth, P. J., & Ellis, P. R. (2016): The role of sugars and sweeteners in food, diet and health: Alternatives for the future. Trends in Food Science and Technology, 56, pp. 158-166.
https://doi.org/10.1016/j.tifs.2016.07.008

[2] White, E., McMahon, M., Walsh, M., Coffey, J. C., & O’Sullivan, L. (2014): Creating Biofidelic Phantom Anatomies of the Colorectal Region for Innovations in Colorectal Surgery. Proceedings of the International Symposium on Human Factors and Ergonomics in Health Care, 3 (1), pp. 277-282.
https://doi.org/10.1177/2327857914031045

[3] Gardner, C., Wylie-Rosett, J., Gidding, S. S., Steffen, L. M., Johnson, R. K., Reader, D., & Lichtenstein, A. H. (2012): Nonnutritive sweeteners: Current use and health perspectives: A scientific statement from the American heart association and the American diabetes association. Circulation, 126 (4), pp. 509-519.
https://doi.org/10.1161/CIR.0b013e31825c42ee

[4] Taskinen, M. R., Packard, C. J., & Borén, J. (2019): Dietary fructose and the metabolic syndrome. Nutrients, 11 (9), pp. 1-16.
https://doi.org/10.3390/nu11091987

[5] Bray, G. A. (2013): Energy and fructose from beverages sweetened with sugar or high-fructose corn syrup pose a health risk for some people. Advances in Nutrition, 4 (2), pp. 220-225.
https://doi.org/10.3945/an.112.002816

[6] Malik, V. S., & Hu, F. B. (2015): Fructose and Cardiometabolic Health What the Evidence from Sugar-Sweetened Beverages Tells Us. Journal of the American College of Cardiology, 66 (14), pp. 1615-1624.
https://doi.org/10.1016/j.jacc.2015.08.025

[7] Rizkalla, S. W. (2010): Health implications of fructose consumption: A review of recent data. Nutrition and Metabolism, 7, pp. 1-17.
https://doi.org/10.1186/1743-7075-7-82

[8] Biró, G. (2018): Human biological characteristics of fructose. Journal of Food Investigation, 64 (1), pp. 1908-1916.

[9] Collino, M. (2011): High dietary fructose intake: Sweet or bitter life? World Journal of Diabetes, 2 (6), pp. 77.
https://doi.org/10.4239/wjd.v2.i6.77

[10] Liu, Y., Ying, Y., Yu, H., & Fu, X. (2006): Comparison of the HPLC method and FT-NIR analysis for quantification of glucose, fructose, and sucrose in intact apple fruits. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 54 (8), pp. 2810-2815.
https://doi.org/10.1021/jf052889e

[11] Giannoccaro, E., Wang, Y. J., & Chen, P. (2008): Comparison of two HPLC systems and an enzymatic method for quantification of soybean sugars. Food Chemistry, 106 (1), pp. 324-330.
https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2007.04.065

[12] Yuan, H., Wu, Y., Liu, W., Liu, Y., Gao, X., Lin, J., & Zhao, Y. (2015): Mass spectrometry-based method to investigate the natural selectivity of sucrose as the sugar transport form for plants. Carbohydrate Research, 407, pp. 5-9.
https://doi.org/10.1016/j.carres.2015.01.011

[13] International Association of Analytical Chemistry, A. (1990): Official Methods of Analysis of the AOAC. Arlington VA

[14] López, M. G., García-González, A. S., & Franco-Robles, E. (2017): Carbohydrate Analysis by NIRSChemometrics. In K. G. Kyprianidis & S. Jan (Eds.), Developments in Near-Infrared Spectroscopy pp. 81-95
https://doi.org/10.5772/67208

[15] Bázár, G., Kovacs, Z., Tanaka, M., Furukawa, A., Nagai, A., Osawa, M., Itakura, Y., Sugiyama, H., Tsenkova, R. (2015): Water revealed as molecular mirror when measuring low concentrations of sugar with near infrared light. Analytica Chimica Acta, 896, pp. 52-62.
https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.09.014

[16] Xie, L., Ye, X., Liu, D., & Ying, Y. (2009): Quantification of glucose, fructose and sucrose in bayberry juice by NIR and PLS. Food Chemistry, 114 (3), pp. 1135-1140.
https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2008.10.076

[17] Rodriguez-Saona, L. E., Fry, F. S., McLaughlin, M. A., & Calvey, E. M. (2001): Rapid analysis of sugars in fruit juices by FT-NIR spectroscopy. Carbohydrate Research, 336 (1), pp. 63-74.
https://doi.org/10.1016/S0008-6215(01)00244-0

[18] Mekonnen, B. K., Yang, W., Hsieh, T. H., Liaw, S. K., & Yang, F. L. (2020): Accurate prediction of glucose concentration and identification of major contributing features from hardly distinguishable near-infrared spectroscopy. Biomedical Signal Processing and Control, 59, pp. 101923.
https://doi.org/10.1016/j.bspc.2020.101923

[19] De Oliveira, V. M. A. T., Baqueta, M. R., Março, P. H., & Valderrama, P. (2020): Authentication of organic sugars by NIR spectroscopy and partial least squares with discriminant analysis. Analytical Methods, 12, pp. 701-705.
https://doi.org/DOI: 10.1039/C9AY02025J

[20] Khadem, H., Eissa, M. R., Nemat, H., Alrezj, O., & Benaissa, M. (2020): Classification before regression for improving the accuracy of glucose quantification using absorption spectroscopy. Talanta, 211 (January), pp. 120740.
https://doi.org/10.1016/j.talanta.2020.120740

[21] Hao, Q., Zhou, J., Zhou, L., Kang, L., Nan, T., Yu, Y., & Guo, L. (2020): Prediction the contents of fructose, glucose, sucrose, fructo-oligosaccharides and iridoid glycosides in Morinda officinalis radix using near-infrared spectroscopy. Spectrochimica Acta - Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy, pp. 234
https://doi.org/10.1016/j.saa.2020.118275

[22] KALL, I. (2020): K-syrup LDX. Retrieved from http://kallingredients.hu/en/products/2/14/k-syrup-ldx

[23] KALL, I. (2020): K-sweet F55. Retrieved from http://kallingredients.hu/en/products/2/12/k-sweet

[24] Naes, T., Isaksson, T., Fearn, T., & Davies, T. (2002): A user-friendly guide to multivariate calibration and classification. Chichester, UK: NIR Publications

Tovább a cikk olvasásához


Gyümölcsjoghurtok eltarthatóságának vizsgálata az ízesítőanyagok kezeléseinek függvényében

Cikk letöltése PDF formátumban

Gyümölcsjoghurtok eltarthatóságának vizsgálata az ízesítőanyagok kezeléseinek függvényében

DOI: https://doi.org/10.52091/EVIK-2021/1-3-HUN

Érkezett: 2020. szeptember – Elfogadva: 2020. december

Szerzők

1 Széchenyi István Egyetem Mezőgazdaság- és Élelmiszertudományi Kar, Élelmiszertudományi Tanszék, Mosonmagyaróvár

Kulcsszavak

joghurtkészítés, mikrohullámú besugárzás, gyümölcsaszalás, mikrobiológiai paraméterek, összcsíraszám, élesztőszám, penészszám, Escherichia coli, coliform

1. Összefoglalás

A tej és a tejtermékek az emberiség táplálkozásának egyik alapját képezik értékes összetevőik és kellemes érzékszervi tulajdonságaik miatt. Kutatásaink célja volt azt vizsgálni, hogy a különböző hőkezelési eljárások (mikrohullámú sugárzás, aszalás), hogyan befolyásolják a tejtermékek (joghurt) eltarthatóságát mikrobiológiai vonatkozásban. Méréseink során a termékek előállításánál felhasznált ízesítőanyagok (alma, banán) eltérő hőkezelési paramétereinek hatását vizsgáltuk a termékek mikrobiológiai tulajdonságaira és ezáltal annak eltarthatóságára nézve. Kísérleteink során az adalékanyagok kezelési formáiként a hagyományos aszalásos (55 °C, 24 óra) és a mikrohullámú sugárzásos technológiát (800 W, 55 °C, 10 perc) alkalmaztunk. Összehasonlításokat végeztünk mikrobiológiai paraméterek tekintetében (összcsíra-szám, élesztő/penész-szám és E. coli/coliform-szám). Eredményeink alapján úgy véljük, hogy az aszalásos eljárás abban az esetben biztosíthat mikrobiológiai biztonságot élelmiszer előállítása során, ha a berendezésben keringő levegő megfelelő higiéniai tulajdonságokkal bír. A mikrohullámú sugárzási technológia az élelmiszerek – jelen esetben gyümölcsök - esetében sikeresen alkalmazható mikrobák gátlására. Ugyanaz a kezelési paraméter azonban nem alkalmazható különböző gyümölcsök esetén.

2. Bevezetés és szakirodalmi áttekintés

A tej az emberiség táplálkozásának egyik alapját képezi az emberiség történelmének kezdetétől fogva. Hasznos összetevői kedvező hatást gyakorolnak az ember egészséges testi és szellemi fejlődésére. A tej alkotórészei élettani szempontból előnyösek, ezek közül is magas kálcium tartalma kiemelkedő, ennél fogva a fejlődő szervezet csontképzésében játszik szerepet [1], valamint a szervezet számára fontos és jól hasznosítható fehérjéket is tartalmaz. Mindezen tulajdonságai révén a tejtermékek az emberi táplálkozás alapélelmiszereinek tekinthetők. Az élelmiszeriparban számos haszonállat tejét feldolgozzák (juh, kecske, szarvasmarha), de Magyarországon legnagyobb mennyiségben a tehéntejet fogyasztják.

A joghurt olyan tejipari termék, amelyet az egész világon fogyasztanak. A táplálkozástudománnyal foglalkozó szakemberek úgy vélik, hogy ez a savanyú tejkészítmény magas táplálkozási értékkel (laktóztartalmának jelentős része elbomlik a fermentáció során és jelentős Ca++ koncentrációval rendelkezik) és előnyös bioaktív hatásokkal (prebiotikus összetevők és probiotikus baktériumok) bír. A natúr joghurtot olyan tejsavbaktériumok hozzáadásával állítják elő, amelyeknek alapvető élettani tevékenységük során a táptalajban tejsavas erjedés zajlik. Az összes, tejből előállított termék közül a joghurt a legnépszerűbb világszerte. [2].

Gyümölcsjoghurt esetében, ha szárított gyümölcsöket vagy szárított darabokat adnak a joghurthoz, a szárítmányok hajlamosak felszívni a joghurtgél szabad vízének egy részét, és ezáltal segítik a termék savójának elválasztását a tárolás során [3]. A gyümölcs adagolásának az is előnye, hogy egyes kutatások [4] szerint 10 v/v%-nyi gyümölcs adalékanyag hozzáadása szignifikánsan javítja a termék fizikai-kémiai tulajdonságait. Az egészséges növényi szövetek belseje nem tartalmaz mikroorganizmusokat, így a növényi nyersanyagok elsődleges mikrobiotája főként a talajból, a vízből, a levegőből esetenként rovaroktól vagy állatoktól származik. A talajban (gumók, gyökerek) és a talaj közelében fejlődő növényi részek általában erősen szennyezettek, mikroflórájuk összetétele gyakorlatilag megegyezik a talajéval. A gyümölcsök felületén körülbelül 103-105 CFU/g nagyságrendben találni mikroorganizmusokat, amelyek egy jelentős részét a tejsav- és az ecetsavbaktériumok teszik ki. A mikrobiota legnagyobb részét azonban az élesztőgombák alkotják, amelyek közül a leggyakoribbak a Hensaniaspora, Torulaspora, Pichia, Saccharomyces, Candida és a Rhodotorula fajok. Gyakori romlást okozó mikroorganizmusok a gyümölcsöknél az Alternaria, Aspergillus, Fusarium, Monilia és a Mucor fajok. A gyümölcsök a penészgombák kiváló táptalajai, melyek között sok mikotoxin termelő is van. A nyersanyag szennyezettsége és a helytelen tárolási körülmények gyakran lehetővé teszik mérgező anyagcseretermékek képződését is. Penészes gyümölcsökből (elsősorban almából és körtéből) mutatható ki például a patulin az Aspergillus és Penicillum gombák által termelt méreganyag (mikotoxin) [5].

A gyümölcsök technológiai feldolgozása során a darabolás, szeletelés, aprítás, hámozás növeli annak valószínűségét, hogy más anyagokról, eszközökről és felszerelésekről származó keresztszennyezés következik be a gyártás és a feldolgozás különböző szakaszaiban. Ezenkívül a cukrok és más tápanyagok megnövekedett elérhetősége a minimálisan feldolgozott gyümölcsökben hozzájárul a mikrobiota változásához és növeli annak populációját [6, 7]. A nyersanyag mikrobiotájának fő tényezői a gyártás során felhasznált anyagok és a feldolgozó berendezések felületének higiéniája, a gyártási környezet és az élelmiszer-kezelők higiéniája, amelyek meghatározzák a végtermék mikrobiológiai minőségét és biztonságát. [8, 9, 10]. Egy, a minimálisan feldolgozott növényi élelmiszerekkel kapcsolatos tanulmány szerzői nagy összes aerob mikroorganizmus-számot mutattak ki az élelmiszerekkel érintkező felületeken, különösen a hámozóberendezéseken, késeken és a vágódeszkákon [10]. Ugyanezen kutatók számoltak be arról is, hogy a vágóasztalokon és a vágódeszkákon magas az Enterobacteriaceae család fakultatív anaerob baktériumainak száma [10]. Bár minden feldolgozóüzem gyártási folyamatai között alkalmaznak mosási és egyéb szennyeződés-mentesítési eljárásokat, mégis nehéz elérni a mikrobiális szennyeződések nagymértékű csökkentését. [11]. A csomagolás és a tárolás időszakában is kialakulhatnak kedvező feltételek a gyümölcsökben és zöldségekben előforduló mikroorganizmusok szaporodásához. Lehto és munkatársai vizsgálataik során aerob mikroorganizmusok nagy számát fedezték fel zöldségfeldolgozó üzemek felületi mintavételei során a már tisztított zöldségekkel érintkező eszközökön és berendezéseken, valamint a tároló-, feldolgozó- és csomagoló helyiségek légterében [10].

Az élelmiszeriparban a hőkezelési eljárások az élelmiszerbiztonság legfontosabb meghatározói. A tej hőkezelése azért van szükség, hogy annak mikrobiológia biztonsága garantálható legyen a tejben lévő patogén mikroorganizmusok elpusztítása révén. Az élelmiszeriparban többféle hőkezelési módszert alkalmaznak. A hőkezelés hatékonyságát szigorúan meghatározott hőmérséklet és hőntartási idő biztosítja. A termékek alapanyagain kívül fontos szerepet tölt be az adalékanyagok megfelelő mikrobiológiai tulajdonságainak biztosítása is. „A hőkezelés a tej, a tejszín stb. melegítésével, hevítésével kapcsolatos művelet, amelynek célja a mikroorganizmusok számának csökkentése, elpusztítása” [12]. A hőkezelés a tejfeldolgozás során általános technológiai lépés, amelynek célja a tej eltarthatóságának javítása a mikroorganizmusok és enzimek inaktiválásával. A kedvező mikrobiológiai állapotú alapanyag használata javíthatja egyes tejtermékek, például a joghurt textúrájának minőségét [13] is.

A mikrohullámú technikát, mint hőkezelési eljárást, elsősorban a háztartásokban használják. Az élelmiszeriparban jelenleg csak egyes területeken tudják megbízhatóan alkalmazni. Ennek oka, hogy a mikrohullámú berendezésekben a hőátadás nem egyenletes, a termékben alul- vagy túlmelegített helyek alakulnak ki. Csőben áramoltatott folyadékoknál – pl. tej mikrohullámú energiával történő kezelése esetén – ez elkerülhető [5]. Ahol használható ez a technika, ott előnyt jelent, mivel az élelmiszereknél alkalmazott kezelések ideje lecsökkenthető, így a technológia gazdaságossá tehető. A költséghatékonyság mellett további előny, hogy a hő- és anyagtranszport iránya azonos, így nem alakul ki az áramlást gátló száraz kéreg [14]. Alkalmazási területei: szárítás, mélyhűtött hús kiolvasztása, temperálás, pasztőrözés, sterilizálás és az élelmiszerek elszíneződésének megakadályozására [15, 16].

A mikrohullámú sugárzásnak sterilizáló és mikrobapusztító hatást is tulajdonítanak. Pozar kísérletei során [17] ezt a hatást 2450 MHz, néhány esetben pedig már 915 MHz frekvencia alkalmazása mellett tudta biztosítani. A sugárzás azáltal növeli az élelmiszerek minőségmegőrzési idejét, hogy az élelmiszerekben található mikrobákat elpusztítja és/vagy szaporodásukat gátolja.

Mikrohullámú sugárzás mikrobákra kifejtett hatását sokféle élelmiszerben, élelmiszer alapanyagban, főleg húsfélékben vizsgálták. A mikrohullámú pasztőrözés [18] elterjedését segítette, hogy alkalmazásával az élelmiszereknél nagymértékű károsodással nem kell számolni, szemben a hagyományos hőközlési eljárásokkal. Ennek oka a rövid hőkezelési és besugárzási idő [19, 20].

A mikrohullámú kezelési technológia mellett hagyományosabb eljárásnak minősül az aszalás, amelynek lényege az, hogy a gyümölcsből – esetenként zöldségből – kíméletes hőközléssel kivonják a víztartalom nagyrészét, ezt követően visszamarad egy intenzív ízű koncentrátum, a kiindulási anyagnál lényegesen kisebb tömegben és méretben. Így az aszalványon maradó mikroszkopikus élőlények a hozzáférhető víz hiánya miatt elvesztik élet- és szaporodó képességüket. A friss gyümölcsök 90-95% vizet tartalmaznak, amely az aszalás után 15% alá csökken. Ilyen módon baktériumok és penészek által előidézett romlás megelőzhető, miközben bizonyos tápanyagok, ballasztanyagok és ásványi anyagok megmaradnak, közülük például a vas. Az aszalt gyümölcsök a friss gyümölcsökhöz képest sok szénhidrátot, rostot és antioxidánsokat, flavonoidokat, fenolsavakat, karotinoidokat és vitaminokat tartalmaznak koncentrált formában [21, 22].

Az élelmiszeripar változatos összetételű joghurt-készítményt állít elő, de a gyártásuk során alkalmazott technológiai műveletek a tej beoltásáig közel azonosak. A tejet általában 2-3%-os starterkultúrával oltják be és 40-45 °C-on inkubálják. Ebben a hőmérsékleti tartományban a kívánt végső savtartalmat 3-4 óra alatt állítják be. Alacsonyabb hőmérséklet (30-37 °C) alkalmazása esetén a művelet hosszabb ideig tart (7-8 óra) ebben az esetben viszont megakadályozható a termék túlzott savasodása [23].

A joghurt ízéért, illatáért és textúrájáért elsősorban a Streptococcus thermophilus baktérium a felelős, és valójában önmagában is képes a pasztőrözött tejet joghurttá erjeszteni, ennek ellenére a fermentációhoz a Streptococcus mellett a Lactobacillus bulgaricus-t is alkalmazzák a termékben keletkező savak előállítása érdekében. A S. thermophilust és az L. bulgaricust általában 1:1 arányban egyszerre oltják be a tejbe (pH 6,6). Arányuk az erjedés előre haladtával megváltozik [24].

3. Anyag és módszer

A termékek gyártása

A termékek gyártásához nyers, hőkezelés nélküli, valamint 2,8 %-os zsírtartalmú UHT fogyasztói tejet (Mizo) használtunk fel, amelyet 2:1 arányban elegyítettünk a joghurtok készítése előtt. A nyerstejet 75 °C-on 15 percig főzőlapon pasztőröztük a megfelelő kezdeti mikrobiológiai biztonság elérése érdekében, majd hozzáadagoltuk a fogyasztói tejet. A hőkezelés után megvártuk, amíg a tej hőmérséklete 30 °C-ra csökken, majd beoltottuk a felhasználási útmutató szerinti mennyiségű (YF-L812, Chr. Hansen, Franciaország) termofil joghurtkultúrával (Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus és Streptococcus thermophilus) és 15 percig kevertük a megfelelő homogenitás biztosítása érdekében. A beoltott tejet 2 dl-es műanyag joghurtos poharakba adagoltuk és 43 °C-os termosztátba (Binder, Németország) helyeztük, ahol 7 órán át alvasztottuk őket (pH 4,6). A savas alvadás után a joghurtokba kevertük az alábbi eljárásokkal kezelt gyümölcsöket.

Kísérletünk során a kontrollminta kivételével kétféle hőkezelési eljárást alkalmaztunk a gyümölcsök esetében, mikrohullámú hőkezelést és hagyományos hőkezelési eljárást (aszalás).

A kísérlet során beállított minták:

  • 1. minta: gyümölcsös joghurt - nyers alma hozzáadásával (Ny-A)
  • 2. minta: gyümölcsös joghurt - nyers banán hozzáadásával (Ny-B)
  • 3. minta: gyümölcsös joghurt - aszalt alma hozzáadásával (A-A)
  • 4. minta: gyümölcsös joghurt - aszalt banán hozzáadásával (A-B)
  • 5. minta: gyümölcsös joghurt - mikrohullámmal hőkezelt alma hozzáadásával (MH-A)
  • 6. minta: gyümölcsös joghurt - mikrohullámmal hőkezelt banán hozzáadásával (MH-B)

A nyers gyümölcsöket tiszta, nyomódástól és hibás részektől mentes, kifogástalan állapotban, optimális érettségi fokban dolgoztuk fel.

A mikrohullámú kezeléshez a MARS 5 (CEM Corporation, USA) mikrohullámú roncsoló berendezést használtunk. A felkockázott nyers almát és banánt a mikrohullámú berendezés mintatartójába helyeztük, majd mikrohullámú kezelésnek vetettük alá. A készüléken az energiaközlési programot úgy állítottuk be, hogy 800 W teljesítménnyel 100%-os hatásfokkal 10 perces hőntartási idővel, a gyümölcsök 55 °C-ra melegedjenek fel, összesen 15 perc alatt. A hőmérséklet detektálását és kontrollálását a mintatartóba vezetett szenzor (RTP 300) segítségével végezte el a berendezés.

Az aszalási folyamatban felhasznált gyümölcsöket egyenlő méretű cikkekre (0,5 cm) vágtuk, hogy azonos idő alatt száradjanak, majd ezután 55 °C-on 24 órán át aszalóberendezésbe helyeztük. Az aszalt, illetve mikrohullámmal hőkezelt gyümölcsöket ezután ledaráltuk. A használat előtt a késeket és a darálóberendezést Mikrozid fertőtlenítővel kezeltük. A ledarált gyümölcsökből 5-5 grammot adagoltunk 150 ml, már elkészült joghurtmintákhoz. A további vizsgálatokig a joghurt-gyümölcs-aszalvány keverékeket hűtőszekrényben 4 °C hőmérsékleten tároltuk.

3.2. A termékek eltarthatósági vizsgálatai

A termékeket 4 héten át vizsgáltuk eltarthatóság szempontjából. A vizsgálatokat a 0., 7., 14., 21. és 28. napon végeztük el. A mikrobiológiai tulajdonságok (összcsíraszám, élesztő/penész-szám, E. coli/coliform-szám) vizsgálatára a gyártástól számítva heti rendszerességgel került sor. A kísérletet minden mintavételi napon 3 párhuzamos méréssel végeztük el (n=3), tehát mintánként (Ny-A; Ny-B, A-A; A-B; MH-A; MH-B) 15 mintával, így a mérések során összesen 90 mintával dolgoztunk.

A mikroorganizmusok tenyésztéséhez lemezöntéses eljárást alkalmaztunk. Élelmiszer-biztonsági és technológiai higiéniai szempontból a 105/cm3 összcsíraszám jelenti nyerstej esetében a kritikus határt, mert a normál pasztőrözési eljárások ennél a mikrobaszámnál még kellő hatékonysággal alkalmazhatók.

Az összes mikrobaszám meghatározását PC (Plate Count, Biolab) táptalajon végeztük el, 30±1 °C-on 72 órás inkubációs idővel [25]. Az MSZ ISO 7954:1999 szabványban rögzített szelektív táptalajon, 25 °C-on való tenyésztéssel az élesztő- és penészgombák telepeket képeznek. A kimutatásukra a szabvány által meghatározott YGC agart (Yeast Extract Glucose Chloramphenicol Agar, Biolab) használtunk. Ez a szelektív táptalaj tejből és tejtermékekből az élesztők és fonalasgombák izolálására és számolására alkalmas. A lemezeket 48 órán át 25±1 °C-on inkubáltuk, ezután a kifejlődött telepeket a lemezeken megszámoltuk [26].

A coliform-szám és az E. coli-szám együttes meghatározását CC agar (ChromoCULT Coliform Agar, Biolab) alkalmazásával lehet megoldani. A telepek elkülönítését segíti, hogy a coliform telepek színe lazac- piros, az E. coli telepek pedig sötétkéktől az ibolyáig változtatják színüket. Az inkubációs paraméterek E. coli/coliform esetében 24 óra 35-37 °C [27].

Mérési eredményeinket Microsoft Office Excel 2016® program segítségével ábrázoltuk. A mikrobiológiai eredmények kiértékelése során a mikrobaszámokat logaritmizált formában jelenítettük meg: az egyes pontokra illesztett egyenesek meredekségi értékei a mikroorganizmusok exponenciális szaporodási fázisát jellemzik.

4. Eredmények és értékelés

4.1. Az almás joghurt minták vizsgálati eredményei

4.1.1. Összcsíraszám

Az 1. ábrán tanúsága szerint a mérés 0., 7. és 14. napján is az összcsíraszám az aszalt almás joghurt és a mikrohullámmal kezelt almás joghurt esetében közel azonos eredményeket mutat. A nyers almás joghurt már a 2. mérés (7. nap) alkalmával magasabb összcsíraszám-értéket értékeket mutatott a másik két mintához képest. Itt már szignifikáns eltérést tapasztalunk a sejtszámok között, amely eltérés az idő elteltével csak növekedett (14. nap). A mikrohullámmal kezelt almával és az aszalt almával kiegészített joghurt esetében a sejtszámok növekedésének tendenciája hozzávetőlegesen azonos mértéket mutatott. Ezt az eredményt az 1. ábrán megjelölt meredekség-értékek is alátámasztják.

1. ábra. Az összcsíraszám meghatározásának eredményei az almás joghurtok esetében

4.1.2. Élesztő/Penész-szám

A 2. ábra alapján megállapítható, hogy az első mérési adattól kezdve az utolsó mérési eredményig a mikrohullámmal kezelt és az aszalt almás joghurt szignifikánsan alacsonyabb élesztőszámot mutat, mint nyers almás joghurt értékei. A MH-A és A-A minták között nem alakult ki ilyen nagyságrendű különbség, azonban a mérés 21. napján már itt is egyértelmű, szignifikáns különbség mutatkozott a MH-A javára. Ezek alapján a mikrohullámmal végzett hőkezelés bizonyult hatásosabbnak az élesztőgombák élettevékenységének gátlásához az általunk alkalmazott kezelési beállítások mellett.

Az almával kiegészített joghurtok esetében egyértelműen megállapítható, hogy az összcsíraszám, az élesztő- és penészszám esetén egyaránt a mikrohullámú technológia mutatkozott a legjobb kezelési eljárásnak. Ehhez hasonló sejtszámokat és szaporodási tendenciákat eredményezett az aszalt gyümölcs adalékot tartalmazó joghurt. A tárolási idő elteltével azonban itt már a sejtszámok között nagyobb különbségek alakultak ki. Eltarthatóság szempontjából a legrosszabb eredényeket a nyers nyümölcsös minták esetében kaptuk. Nagyságrendnyi különbségeket mértünk a másik két mintához képest, szignifikáns elétrések voltak tapasztalhatók (p≤0,05).

2. ábra. Az élesztőgombaszám meghatározás eredményei az almás joghurtok esetében

A 21. napon, a harmadik mintavételi időpontban a mikrohullámmal kezelt almás joghurtokat leszámítva, a nyers, és az aszalt almás joghurtok megromlottak. A harmadik mérés után a nyers, valamint az aszalt almás joghurtokban a magas élesztőgombaszám mellett jelentős számú penészgomba jelent meg. A mikrohullámmal kezelt almás joghurtokon ezzel szemben a harmadik mérést követően sem voltak kimutatható penészgombatelepek.

Penészgombaszámra vonatkozóan a hatályos rendelet [27] alapján a fermentált tej, tejtermék, savanyított tejtermék, túró, túrókészítmények esetén a megfelelőség szint (m) 102 CFU/cm3 a visszautasítás határértéke (M) 5*103 CFU/cm3.

Penészgombák tekintetében az almás joghurtok esetében az első két mérés alkalmával, a 0. és 7. napon nem mutattuk ki a penészgombák jelenlétét. A kísérlet 14. napján a nyers gyümölcsös és az aszalt almás mintánál megjelentek a penészgombák telepei, nyers alma estében már a rendelet által meghatározott visszautasítási szint feletti értékkel (3*104 CFU/cm3). Az aszalt almás termék esetében azonban a vonatkozó előírások szerint [27] még elfogadható szinten (2,2*102 CFU/cm3) marad penészgomba-telepek száma.

4.2. A banános joghurt vizsgálati ereményei

4.2.1. Összcsíraszám

A banános joghurtok esetében megállapítottuk, hogy a kétféle kezelési eljárás (aszalás, mikrohullám) szintén hatással van a mikrobaszám alakulására. A mikrohullámmal kezelt minta esetén a mikrobaszám emelkedése a kísérlet 21. napjáig nem mutatott intenzív növekedést a kezdeti sejtszámhoz képest (3. ábra). Ezzel ellentétben a nyers és aszalt gyümölccsel kiegészített joghurtok esetében az összcsíraszám hétről-hétre emelkedett. Mindezek mellett azt is megállapítottuk, hogy az aszalt gyümölccsel kiegészített minta sejtszáma a legmagasabb, és ennél a mintánál tapasztaltuk a sejtszám legintenzívebb növekedését is. A tárolási kísérlet 7. napján már szignifikáns különbségek alakultak ki a minták vizsgálati eredményei között, ezek közül is az A-B minta tér el nagyságrendileg a Ny-B és MH-B mintáktól. A mérés 14. napján már mindhárom minta adata között nagyságrendnyi eltéréseket tapasztaltunk. Összcsíraszám tekintetében a MH-B minta esetében volt legalacsonyabb a sejtszám növekedés.

3. ábra. Az összcsíraszám meghatározás eredményei a banános joghurtok esetében

4.2.2. Élesztő/penész szám

Az élesztőszám eredményei (4. ábra) alapján megállapítottuk, hogy a nyers- és mikrohullámmal kezelt banános joghurtok esetében nincs számottevő különbség a minták telepszámainak, illetve a mikroorganizmusok szaporodási tendenciái tekintetében. Az aszalt almás joghurtok esetében azonban a sejtszám gyors növekedése volt jellemző, ami a termék organoleptikus tulajdonságait is befolyásolta. A mintavétel 7. napjától már szignifikáns különbségek alakultak ki a MH-B és Ny-B valamint a A-B és Ny-B minták között. A leghatékonyabbnak ebben az esetben is a mikrohullámú kezelés bizonyult.

A banános joghurtok esetében is vizsgáltuk a penészszám alakulását az eltarthatósági idő alatt. Az eredmények azt mutatták, hogy az első két mérés alkalmával, a 0. és a 7. napon a penésztelepek nem alakultak ki. A kísérlet 14. napján azonban az aszalt banános mintánál penészgombák jelentek meg 1,4*104 CFU/cm3 mennyiségben, amely jóval meghaladja a rendelet szerinti megfelelőségi határértéket (102 CFU/cm3), sőt már a visszautasítási kategóriába esik (5*103 CFU/cm3). A másik két minta (nyers és mikrohullámmal kezelt banán) esetében a 14. napon penészgombák nem voltak jelen. A kísérlet 21. napján a nyers banánnal kiegészített joghurtban is megjelentek a penészgombák 3,0*101 CFU/cm3 mennyiségben, amely még nem haladja meg a megfelelőségi határértéket. Az MH-B mintánál penészgomba még mindig nem volt kimutatható. A kísérlet 28. napján a penészgombaszám a nyers banános joghurt esetben is hozzávetőlegesen 1 nagyságrenddel meghaladta a visszautasítási határértéket. Az MH-B mintánál penészgomba még a 28. napon sem volt kimutatható.

Az aszalt termékek esetén kapott eredmények arra engednek következtetni, hogy a kíméletes hőkezeléssel végzett 24 órás aszalás nem javította kellő mértékben a felhasznált anyagok mikrobiológiai állapotát. Feltehető, hogy az aszalóberendezésen átáramló levegő higiéniai állapota sem volt megfelelő. Úgy véljük, hogy a joghurt készítményekhez előkészített gyümölcsök aszalását csak olyan helyiségben és berendezésben célszerű végezni, amelynek levegője kifogástalan, valamint elszívó és megfelelő légszűrőrendszerrel rendelkezik.

4.2.3. A joghurtok E. coli/coliform eredményei

Az Escherichia coli baktérium a normál bélflóra legfontosabb mikrobája, így minden melegvérű állat és az ember emésztőrendszerének természetes összetevője. Az élelmiszerekbe gyümölcsökről, zöldségekről kerülhet, ha azokat nem tisztították elég alaposan, de a nyers tejben vagy az abból készült tejtermékekben is előfordulhat.

4. ábra. Az élesztőszám meghatározás eredményei a banános joghurtok esetében

A hatályos rendelet [28] alapján a fermentált tej, tejtermék, savanyított tejtermék, túró, túrókészítmények esetén a megfelelőség szint (m)<1/CFU/cm3 a visszautasítás határértéke (M)<10/CFU/cm3.

A kísérlet 0. és 7. napján elvégzett vizsgálatok alakalmával E. coli baktérium az általunk előállított minta egyikében sem volt kimutatható. A kísérlet 21. napján (3. hét) azonban a nyers banános és mikrohullámmal kezelt banános mintákon kívül az összes joghurtban kimutathatóvá vált a baktérium. A mérés 4. hetére az E. coli a nyers banános joghurtban is megjelent. Így a vizsgálat végére csak a mikrohullámmal kezelt banánnal kiegészített joghurt felelt meg a jogszabályi előírásoknak.

A coliform baktériumok megtalálhatók a vizes élőhelyeken, a talajban és a növényzeten; és általában nagy számban vannak jelen a melegvérű állatok székletében.

A hatályos – 4/1998. (XI. 11.) EüM – rendelet alapján a fermentált tej, tejtermék, savanyított tejtermék, túró, túrókészítmények esetén a megfelelőség szint (m)<10 CFU/cm3 a visszautasítás határértéke (M)<102 CFU/cm3.

A coliform baktériumokat a kísélrlet 0. napján az összes mintában kimutattuk, azonban a nem megfelelőségi határértéket csak az aszalt gyümölccsel kiegészített joghurtok mintáinak eredményei haladták meg. 1 hét elteltével azonban a coliformok csak az aszalt banános joghurt esetében voltak kimutathatók. Valószínűleg a joghurt pH értékének csökkenése akadályozta a baktériumok szaporodást és életben maradását.

A mérés 3. hetében a nyers gyümölccsel kiegészített mintáink esetében észleltünk coliform baktériumokat a többi mintában nem voltak jelen. Esetünkben a nyers gyümölccsel kiegészített minták elérték az M értéket, így 21 nap eltelte után a termékek nem voltak alkalmasak emberi fogyasztásra.

A mikrobiológiai vizsgálatok során a rendelet alapján előírt Salmonella és Staphylococcus aureus meghatározását is elvégeztük. Ezek a vizsgálatok minden esetben negatív eredményt hoztak.

Schnabel és munkatársai hétféle mikrobatörzzsel fertőzött meg (köztük az általunk vizsgaált E. coli baktériummal) nyers gyümölcsöket 108 nagyságrendű sejtszámmal. Ezután mikrohullámmal támogatott plazmával kezelték a mintákat, amelynek hatására a sejtszámot már 5 perces kezelés után 4 nagyságrenddel volt képes csökkenteni. A kezelést non-termális körülmények között (30 °C-on) végezték, kizárva ezzel a hőmérséklet mikrobapusztító hatását [29].

Ez a jelenség munkacsoportunk mérései során abban nyilvánult meg, hogy az E. coli mikrohullámmal kezelt banános joghurtban a mérés 28. napjára sem volt kimutatható, szemben a nyers- és aszalt banános joghurtokkal. Ezzel szemben az almával kevert joghurtokban sajnos a kísérlet végére az E. coli jelenlétét észleltük.

Picouet és munkatársai kimutatták, hogy a mikrohullámú kezelések az E. coli O157: H7 és összcsíraszám értékeket hasonlóképpen befolyásolták, 1,01-1,16 log CFU g-1 csökkenést detektáltak. Ugyanezen kezelési paraméterek nagymértékben befolyásolta az L. innocua-t, a populációk a kimutatási határ alatt voltak (10 CFU g-1) a legtöbb esetben. Alma pürémintákban az összcsíraszám stabil maradt az 5 °C-on történő tárolás során, enyhe növekedéssel a 14. napon [30]. Ez a tendencia saját méréseink során is megfigyelhető volt. Eredményeink igazolják, hogy megvalósítottuk kutatásunk célkitűzését, amely a mikrohullámú kezelés mikrobapusztító és gátló hatásának igazolása volt.

Eredményeinket az is alátámasztja, hogy 5-25 másodperces (65 °C, 1200 W, 2,45 GHz) mikrohullámú kezelés képes zöldségek esetében a Salmonella sejtszámot 4-5 nagyságrenddel csökkenteni, ezzel is igazolható a mikrohullám többi kezeléshez viszonyított erősebb mikrobapusztító hatása [31].

5. Következtetések és javaslatok

A joghurtok ízesítő anyagaként felhasznált gyümölcsök esetében kétféle hőkezelést alkalmaztunk a termékek eltarthatóságának növelése érdekében. A mikrohullámú kezelési eljárás eltarthatóságra kifejtett hatását a hagyományos és kezeletlen gyümölcsök joghurtba való adagolása utáni eltarthatósági idő hosszával jellemeztük.

A mikrobiológia vizsgálatok alapján megállapítottuk, hogy a különböző hőkezelések közül a mikrohullámú kezelés volt a leghatékonyabb. A gyümölcsök hőkezelésének módszerei közül a mikrohullámú besugárzás eredményezett alacsonyabb csíraszámot a kezeletlen és az aszalásos technológiához képest.

A mikrobiológiai eredményeink alapján úgy véljük, hogy a nyers gyümölcs szennyezettsége vagy textúrája alapvetően befolyásolja a kezelés hatékonyságát. A banán mikrohullámú kezelése után a joghurtban kísérleteink végére (28. nap) sem volt kimutatható az E. coli baktérium jelenléte, szemben a kezelt alma esetében, ahol a 14. napon már kimutattuk annak jelenlétét. Ez azért lehet említésre méltó, mert a termék készítésének napján egyik esetben sem észleltük az E. coli jelenlétét. Feltételezhető, hogy a mikrohullámú sugárzás banán puha textúrájába intenzívebben fejtette ki csíraölő hatását, mint a keményebb konzisztenciájú alma esetében.

Megállapítottuk, hogy az aszalásos eljárás abban az esetben alkalmas mikrobiológiailag biztonságos élelmiszer előállítására, ha a berendezésben keringő levegő mikrobiológiai állapota is megfelelő.

Eredményeink alapján feltételezzük, hogy a mikrohullámú besugárzási technológia az élelmiszerek – jelen esetben gyümölcsök – esetében sikeresen alkalmazható az élelmiszerek belsejében, illetve felületén élő mikroorganizmusok gátlására.

Az almával ízesített joghurtok esetén a nyers gyümölcsös minták mikrobiológiai jellemzői voltak rosszabbak, ezekkel szemben a banán esetében az aszalásos technológia bizonyult mikrobiológiai szempontból a legkedvezőtlenebbnek. Ennek valószínű oka az lehet, hogy a banán az almával összehasonlítva átlagosan háromszor nagyobb mennyiségű szénhidrátot tartalmaz, amely az aszalás következtében koncentrálódott. A joghurtba kevert magas szénhidrát tartalmú gyümölcs pedig tápanyagként szolgálhatott a különböző mikroorganizmusok számára.

Annak érdekében, hogy megállapítsuk, hogy a mikrohullámban 55 °C-tól eltérő hőmérséklet, eltérő teljesítmény és kezelési időtartam alkalmazása eltarthatóság szempontjából kedvezőbb eredményeket hozna-e vagy sem, további vizsgálatok elvégzésére van szükség.

A hőkezelési eljárások közül a mikrohullám alkalmas lehet mind a tej kezelésére, így a mikrobaszám csökkentésére, mind pedig az alkalmazott ízesítőanyagok (fűszerek, gyümölcsök, zöldségek) csíraszámának csökkentésére.

6. Köszönetnyilvánítás

A publikáció elkészítését az EFOP-3.6.1-16-2016-00024 azonosítószámú „Intelligens szakosodást szolgáló fejlesztések az Állatorvostudományi Egyetem és a Széchenyi István Egyetem Mezőgazdaság- és Élelmiszertudományi Karának együttműködésében” című projekt támogatta. A projekt az Európai Unió támogatásával, az Európai Szociális Alap társfinanszírozásával valósult meg.

7. Irodalom

[1] Kukovics, S. (2009): A tej szerepe a humán táplálkozásban. Melánia Kiadó, Budapest.

[2] Coïsson, J.D., F. Travaglia, G. Piana, M. Capasso and M. Arlorio, (2005): Euterpe oleracea juice as a functional pigment for yogurt. Food Research International, 38 (8-9) pp. 893-897. https://doi.org/10.1016/j.foodres.2005.03.009

[3] Tamime, A.Y., Robinson. R.K. (1999): Yoghurt, Science and Technology. Cambridge, UK: Woodhead Publishing Limited. https://doi.org/10.1201/9780415876162

[4] Tarakci, Z., Kücüköner, E. (2003): Physical, chemical, microbiological and sensory characteristics of some fruit flavored yoghurt. Yüzüncü Yıl Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dergisi 14 (2) pp. 10-14.

[5] Deák, T. (2006): Élelmiszer mikrobiológia. Mezőgazda Kiadó, Budapest.

[6] Oms-Oliu G., Rojas-Grau M.A., Gonzalez L.A., Varela P., Soliva-Fortuny R., Hernando M.I.H., Munuera I.P., Fiszman S., & Martin-Belloso, O. (2010): Recent approaches using chemical treatments to preserve quality of fresh-cut fruit: A review. Postharvest Biology and Technology 57 (3) pp. 139-148. https://doi.org/10.1016/j.postharvbio.2010.04.001

[7] Pasha, I., Saeed, F., Sultan, M.T., Khan, M. R., & Rohi, M. (2014): Recent developments in minimal processing: A tool to retain nutritional quality of food. Critical Reviews in Food Science and Nutrition 54 (3) pp. 340-351. https://doi.org/10.1080/10408398.2011.585254

[8] Abadias, M., Usall, J., Anguera, M., Solsona, C., & Viñas, I. (2008): Microbiological quality of fresh, minimally-processed fruit and vegetables, and sprouts from retail establishments. International Journal of Food Microbiology, 123 (1-2) pp. 121-129. https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2007.12.013

[9] Johnston, L. M., Jaykus, L. A., Moll, D., Martinez, M. C., Anciso, J., Mora, B., & Moe, C. L. (2005): A field of study of the microbiological quality of fresh produce. Journal of Food Protection 68 (9) pp. 1840-1847. https://doi.org/10.4315/0362-028X-68.9.1840

[10] Lehto, M., Kuisma, R., Maatta, J., Kymalainen, H. R., & Maki, M. (2011). Hygienic level and surface contamination in fresh-cut vegetable production plants. Food Control 22 (3-4) pp. 469-475. https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2010.09.029

[11] Beuchat, L. R. (1998): Progress in conventional methods for detection and enumeration of foodborne yeasts. Food Technology and Biotechnology 36 (4) pp. 267-272.

[12] Magyar Élelmiszerkönyv (Codex Alimentarius Hungaricus): 2-51 számú irányelv, Tej és tejtermékek, Dairy products

[13] Vasbinder, A. J.; C. G. De Kruif. (2003): Casein-whey protein interactions in heated milk: the influence of pH. International Dairy Journal 13 (8) pp. 669-677. https://doi.org/10.1016/S0958-6946(03)00120-1

[14] Berecz, L. (1999): Élelmiszerek száradási jellemzői, különös tekintettel az élesztőkre, PhD disszertáció, Pannon Agrártudományi Egyetem, Mezőgazdaságtudományi Kar, Mosonmagyaróvár

[15] Tang, Z. W., Mikhaylenko, G., Liu, F., Mah, J.H., Pandit, R., Younce, F., Tang, J.M., (2008): Microwave sterilization of sliced beef in gravy in 7-oz trays. Journal of Food Engineering 89 (4) pp. 375-383. https://doi.org/10.1016/j.jfoodeng.2008.04.025

[16] Venkatesh, M.S., Raghavan, G.S.V., (2004): An overview of microwave processing and dielectric properties of agri-food materials. Biosystems Engineering 88 (1) pp. 1-18. https://doi.org/10.1016/j.biosystemseng.2004.01.007

[17] Pozar, M.D. (1993): Microwave Engineering, Addison-Wesley Publishing Company.

[18] Rosenberg, U., Bogl, W. (1987): Microwave pasteurization, sterilization, blanching, and pest control in the food industry. Food Technology 41 (6) pp. 92-99.

[19] Lau, M.H., Tang, J. (2002): Pasteurization of pickled asparagus using 915 MHz microwaves. Journal of Food Engineering 51 (4) pp. 283-290. https://doi.org/10.1016/S0260-8774(01)00069-3

[20] Wang, Y., Wig, T.D., Tang, J., Hallberg, L.M. (2003): Dielectric properties of foods relevant to RF and microwave pasteurization and sterilization. Journal of Food Engineering 57 (3) pp. 257-268 https://doi.org/10.1016/S0260-8774(02)00306-0

[21] Bennett, L.E., Jegasothy, H., Konczak, I., Frank, D., Sudharmarajan, S., Clingeleffer, P.R. (2011): Total polyphenolics and anti-oxidant properties of selected dried fruits and relationships to drying conditions. Journal of Functional Foods 3 (2) pp. 115-124. https://doi.org/10.1016/j.jff.2011.03.005

[22] Donno, D., Beccaro, G.L., Mellano, M.G., Cerutti, A.K., & Bounous G. (2015): Goji berry fruit (Lycium spp.): antioxidant compound fingerprint and bioactivity evaluation. Journal of Functional Foods 18 (B) pp. 1070-1085. https://doi.org/10.1016/j.jff.2014.05.020

[23] Hassan, A.N., Ipsen, R., Janzen, T., Qvist, K.B., (2003): Microstructure and rheology of yogurt made with cultures differing only in their ability to produce exopolysaccharides. Journal of Dairy Science 86 (5) pp. 1632-1638. https://doi.org/10.3168/jds.S0022-0302(03)73748-5

[24] Huang, L., Lu, Z., Yuan, Y., Lu, F., Bie, X., (2006): Optimization of a protective medium for enhancing the viability of freeze-dried Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus based on response surface methodology. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology 33 (1) pp. 55-61. https://doi.org/10.1007/s10295-005-0041-8

[25] Magyar Szabványügyi Testület (MSzT) (2014): Az élelmiszerlánc mikrobiológiája. Horizontális módszer a mikroorganizmusok számlálására. 1. rész: Telepszámlálás 30 °C-on lemezöntéses módszerrel Magyar Szabvány MSZ EN ISO 4833-1:2014. Magyar Szabványügyi Testület, Budapest.

[26] Magyar Szabványügyi Testület (MSzT) (1999): Mikrobiológia. Általános útmutató élesztők és penészek számlálásához. Telepszámlálási technika 25 °C-on. Magyar Szabvány MSZ ISO 7954:1999. Magyar Szabványügyi Testület, Budapest.

[27] Magyar Szabványügyi Testület (MSzT) (2014): Az Escherichia coli és coliform baktériumok megszámlálása. 2. rész: A legvalószínűbb szám módszere (EN ISO 9308-2:2014). Angol Szabvány MSZ EN ISO 9308-2:2014. Magyar Szabványügyi Testület, Budapest.

[28] 4/1998. (XI. 11.) EüM rendelet: Az élelmiszerekben előforduló mikrobiológiai szennyeződések megengedhető mértékéről (hatályos: 2020. 04. 02.)

[29] Schnabel, U., Niquet , R., Schlüter, O., Gniffke, H.; Ehlbeck, J. (2014): Decontamination and sensory properties of microbiologically contaminated fresh fruits and vegetables by microwave plasma processed air (PPA). Journal of Food Processing and Preservation 29 (6) pp. 1745-4549. https://doi.org/10.1111/jfpp.12273

[30] Picouet, P. A., Landl, A., Abadias, M., Castellari, M., Viñas, I. (2009): Minimal processing of a Granny Smith apple purée by microwave heating, Innovative Food Science and Emerging Technologies 10 (2009) pp. 545-550. https://doi.org/10.1016/j.ifset.2009.05.007

[31] Vega, M., López, S., Malo, L., Morales, S. (2012): Inactivation of Salmonella typhimurium in fresh vegetables using water-assisted microwave heating. Food Control 26 (1) pp. 19-22. https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2012.01.002

Tovább a cikk olvasásához


Élelmiszerekből izolált staphylococcus fajok antibiotikum rezisztencia vizsgálata

Cikk letöltése PDF formátumban

Élelmiszerekből izolált staphylococcus fajok antibiotikum rezisztencia vizsgálata

DOI: https://doi.org/10.52091/EVIK-2021/2-1-HUN

Érkezett: 2021. február – Elfogadva: 2021. április

Szerzők

a Debreceni Egyetem, Mezőgazdaság-, Élelmiszertudományi és Környezetgazdálkodási Kar, Élelmiszertudományi Intézet
b BIOMI Kft.
c Pázmány Péter Katolikus Egyetem
d WESSLING Hungary Kft.
e Állatorvostudományi Egyetem
* Levelező szerző: horvath.brigitta920108@gmail.com

Kulcsszavak

élelmiszer, Staphylococcus, antibiotikum rezisztencia, MALDI-TOF-MS, baktérium identifikálás, élelmiszerbiztonság, humán patogén, nozokómiás fertőzés

1. Összefoglalás

A methicillin-rezisztens Staphylococcus aureus (MRSA) törzsek élelmiszerláncban előforduló jelenlétét számos tanulmány igazolta az Európai Unióban, azonban Magyarországon kevés adat áll rendelkezésünkre ezzel kapcsolatban. Jelen vizsgálat célja az élelmiszerekből izolált Staphylococcus törzsek antibiotikum rezisztenciá-jának vizsgálata klasszikus mikrobiológiai, molekuláris biológiai módszerekkel és MALDI-TOF-MS technikával, továbbá az antibiotikum rezisztens törzsek multilókusz szekvencia tipizálása (MLST). A vizsgálat során 47 koaguláz-pozitív (CPS) és 30 koaguláz-negatív Staphylococcus (CNS) izolátumot gyűjtöttünk. A MALDI-TOF-MS vizsgálat során minden CPS izolátum (n=47) S. aureus fajnak bizonyult, míg a CNS törzsek esetében 8 különböző fajt azonosítottunk. Két S. aureus törzs esetében állapítottunk meg methicillin-rezisztenciát, amelyek közül az egyik izolátum eddig még nem ismert szekvencia típusba, míg a másik MRSA törzs az ST398 típusba tartozott, amely a mezőgazdasági haszonállatokból izolált MRSA törzsek leggyakoribb típusa az EU/EGT területén.

(Az „MRSA” rövidítést köznapi szóhasználatban, de esetenként a szakirodalomban is gyakran a „multirezisztens Staphylococcus aureus” megjelölésére használják. A szerzők kéziratában - helyesen a methicillin-rezisztens kórokozót jelölik így. A Szerk.)

2. Bevezetés és irodalmi áttekintés

Az antibiotikum rezisztens mikroorganizmusok által okozott nozokómiális infekciók (kórházhigiénés fertőzések – a szerk.) száma minden országban növekedést mutat, ezáltal egyre nagyobb kihívás elé állítva az egészségügyi ellátórendszert [1, 2]. A helyzetet tovább súlyosbítja az a tény, hogy az antibiotikum rezisztens Staphylococcus fajok már nem csak a közösségekben és az egészségügyben, hanem az intenzív állattartásban, ezáltal az élelmiszerláncban is megjelentek [3].

A Staphylococcus fajokban az antibiotikum rezisztenciával és virulenciával kapcsolatos gének a mobilis genetikai elemekben (MGE) találhatók, mint például a kromószóma kazettákban, patogenitási szigeteken, plazmidokban vagy transzpozonokban [4]. A methicillinnel szembeni rezisztenciáért a mecA gén felelős: a gén egy módosított penicillin-kötő fehérjét kódol, amely csökkenti a legtöbb béta-laktám antibiotikum, így a penicillin és a methicillin kötődési affinitását. A mecA gén a Staphylococcus kromószóma kazettán (SSCmec) található, amely egy MGE csoport és csak a Staphylococcus fajokban található meg [5]. A mecA gén Staphylococcus fajok közötti átvitelének mechanizmusa nem ismert, azonban bizonyítékok támasztják alá a horizontális géntranszfert a koaguláz-pozitív és koaguláz-negatív Staphylococcus fajok között [6].

A methicillin-rezisztens Staphylococcus aureus (MRSA) törzsek élelmiszerláncban előforduló jelenlétéről már több tanulmány beszámolt. Szerzőik egy része állati eredetű élelmiszermintákból, másik része pedig nyers húsmintákból (sertés, hal, baromfi) izolált törzsek vizsgálatát végezte el. Hollandiában 2009-ben 2217 különböző élelmiszermintát vizsgáltak meg, amelynek a 12%-a MRSA törzsnek bizonyult [7], míg egy dániai vizsgálat során 153 sertéshúsmintának a 4,6%-a, az importált 173 sertéshúsmintának pedig a 7,5%-a volt fertőzött MRSA törzzsel [8]. Németországban nyers tejből, sertéshúsból, pulykahúsból és brojler csirkehúsból is azonosítottak MRSA törzseket [9]. Magyarországon egy tehenészeti telep 595 egyedi tejmintájából 27 db MRSA izolátumot azonosítottak [10], egy másik vizsgálatban 42 telep 626 S. aureus izolátuma közül csak 4 törzs bizonyult methicillin rezisztensnek [11]. Ezeken túl azonban más élelmiszerkategóriából származó és fogyasztásra kész élelmiszerekből eddig nem vizsgálták az MRSA jelenlétét. A törzsek molekuláris tipizálási eredményei rámutattak arra, hogy az MRSA számos típusa jelen van az élelmiszerláncban a különböző országokban [12], azonban a leggyakrabban a CC398-as típus fordult elő, amely az EU és az EGT területén a mezőgazdasági haszonállatokból izolált MRSA törzsek 85%-át teszi ki [13, 14, 7,15].

A további methicillin-rezisztens Staphylococcus (MRS) fajok előfordulását az élelmiszerekben azonban már kevesebb tanulmány vizsgálta. Nigériában 255 tradicionális ételből származó izolátumból 13 Staphylococcus faj (S. xylosus, S. epidermidis, S. simulans) mutatott methicillin-rezisztenciát [16]. Egy Lengyelországban végzett tanulmány során 58 készételből izolált törzsből 33 Staphylococcus törzs (S. epidermidis, S. simulans, S. xylosus, S. hycus, S. lentus, S. saprophyticus) mutatott rezisztenciát legalább egy fajta antibiotikummal szemben [17].

Az Európai Unióban az élelmiszerekből és haszonállatokból izolált Staphylococcus törzsek antibiotikum rezisztenciájának ellenőrzése jelenleg önkéntes, ezért 2016-ban csak Németország, Svájc, Dánia és Spanyolország jelentett ezzel kapcsolatos információt. Az MRSA előfordulási gyakorisága országonként eltérő volt, ám az összehasonlítás során figyelembe kell venni, hogy a vizsgálatokat eltérő állatfajokból, húsokból és húskészítményekből izolált törzseken végezték el [18]. A humán fertőzések kis hányada vezethető vissza a CC398-as típusú MRSA törzsekre és azok is legfőképp szakmai expozíciókra korlátozódnak, mint az állatgyógyászat és az intenzív állattartás. Ennek ellenére a CC398-as típusú MRSA törzsekben kimutatható virulencia faktorok lehetővé teszik a magas patogenitást, így a folyamatos revízió mind az állatokban, mind az élelmiszerekben elengedhetetlen [19]. A felügyelet szükségességét az egyéb Staphylococcus fajok antibiotikum rezisztenciájának esetleges fennállása is indokolja, amely lehetőséget nyújt a rezisztencia terjedésére, és veszélyt jelent a fogyasztók egészségére.

A sikeres felügyeleti rendszer elengedhetetlen feltétele, hogy egy egységes, gazdasági szempontból is elfogadható, gyors és megbízható módszer álljon rendelkezésre a mikroorganizmusok faji szintű azonosításában és antibiotikum rezisztencia meghatározásában, amelynek ígéretes alappillére lehet a fehérje azonosításon alapuló (peptide mass fingerprint) mátrix-asszisztált lézer deszorpciós, ionizációs, repülési idő mérésén alapuló tömegspektrometria (MALDI-TOF-MS). A 2000-es évek kezdetén számos tanulmány számolt be olyan specifikus fragment ionokról, amelyek lehetővé teszik az antibiotikum rezisztens Staphylococcus törzsek gyors azonosítását. A legtöbbet vizsgált biomarker a 2414 m/z értékű fragment ion volt, amelynek megjelenése a tömegspektrumban az MRSA törzsekre jellemző psm-mec expressziójával korrelál [20]. A detektáláshoz és diszkriminációhoz a 2414 m/z értékű fragment ion alkalmazhatóságát több tanulmány is igazolta [21, 22].

Az MRSA törzsek biomarkereinek vizsgálatain kívül más tanulmányok további Staphylococcus fajok methicillin-rezisztencia specifikus fragment ion csúcsait elemezték. Egy korábbi cikkben két specifikus fragment ion-értéket határoztak meg: a 7239 m/z értékű ion fragment-csúcsot, amely a methicillin-rezisztens S. epidermidis és a 9674 m/z fragment-ion csúcsot, amely a methicillin-rezisztens S. haemolyticus biomarkere [23].

Saját kísérleteink célja az élelmiszerekből izolált Staphylococcus törzsek methicillin rezisztenciájának vizsgálata klasszikus mikrobiológiai, molekuláris biológiai módszerekkel és MALDI-TOF-MS technikával, továbbá az antibiotikum rezisztens törzsek multilókusz szekvencia tipizálása volt (MLST) a törzsek epidemiológiai vizsgálata céljából.

3. Vizsgálati anyag és módszer

3.1. Gyűjtött izolátumok és tenyésztési körülmények

A WESSLING Hungary Kft. Mikrobiológiai laboratóriumában a 2019. augusztus és 2020. szeptember közötti időszakban az MSZ EN ISO 6888-1:2008 szabvány előírásai alapján izolált 77 Staphylococcus izolátumot vizsgáltunk. Az izolátumokat 37 °C-on, 24±1 órán keresztül Baird-Parker (Biokar, Franciaország) szelektív táptalajon tenyésztettük és a Staphylococcusokra jellemző kolóniákat Columbia véres agarra (Neogen, UK) oltottuk át (37 °C, 24±1 óra). A tenyésztés során 47 törzs mutatott pozitív koaguláz reakciót, míg 30 izolátum koaguláz-negatívnak bizonyult, amelyet latex agglutinációs gyorsteszttel (PASTOREX™ STAPH-PLUS) is igazoltunk. Az izolátumokat nyers húsból, húskészítményekből és fogyasztásra készételekből gyűjtöttük: baromfi (n=14), marha (n=5), sertés (n=42), vad (n=1), hal (n=1), tejtermék (n=3), készételek (n=3), zöldségek (n=2) és száraztészta (n=6).

3.2. Izolátumok azonosítása MALDI-TOF-MS technikával

A gyűjtött 77 izolátum azonosítását Bruker Microflex LT MALDI-TOF tömegspektrométerrel és a MALDI BioTyper 3.1 (Bruker Daltonics) szoftverrel végeztük el. Hangyasavas szuszpendálási protokollt alkalmaztunk, amely során Columbia véres agarról egy önálló telepet vettünk fel egy steril kacs segítségével, majd 40 µl hangyasavban szuszpendáltunk el. A szuszpenzióhoz 40 µl acetonitrilt adtunk, amelyből a lemez egyik pozíciójára 1 μl-t cseppentettünk fel. A csepp beszáradását követően a mintákra 1 μl α-HCCA (10 mg/ml α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid) mátrix oldatot vittünk fel és a mintát ismét hagytuk beszáradni. Valamennyi minta esetében 6 párhuzamos mérést végeztünk.

Az izolátumok azonosítása során MALDI Biotyper 3.1 szoftvert alkalmaztunk, amely a kapott tömegspektrumokat az adatbázisában szereplő referencia tömegspektrumokhoz hasonlítja és egy megfelelőségi faktort (score) számít ki. 2,300 – 3,000 log score érték esetén az azonosság igen valószínű. Ekkora log score érték esetén a faj azonosítottnak tekinthető. Amennyiben 2,000 – 2,299 közötti log score értéket kapunk, az azonosság kisebb, így ez esetben csak a mikroorganizmus nemzetsége tekinthető azonosítottnak. 1,700 – 1,999 log score érték között a nemzetség (genus) azonosítása sem tekinthető megfelelően biztosnak. Ha az értékelő szoftver 0,000 – 1,699 közötti log score értéket ad meg, az azonosítást sikertelennek kell tekinteni. A vizsgálatba bevont koaguláz-pozitív Staphylococcus törzsek azonosítását korábban végeztük el [24].

3.3. Antibiotikum érzékenységi vizsgálat

3.3.1. Methicillin-rezisztencia specifikus csúcsok vizsgálata MALDI-TOF-MS módszerrel

A kapott tömegspektrumokat a flexAnalysis 3.4 szoftverbe (Bruker Daltonics) exportáltuk és elvégeztük a tömegspektrumok manuális elemzését és összehasonlítását. A tömegspektrumok simítását a Savitzky–Golay szűrővel, az alapvonal korrekcióját pedig a TopHat algoritmussal végeztük el. Az elemzés során a methicillin-rezisztencia (MR) specifikus fragment ionok jelenlétét vizsgáltuk (1. táblázat).

1. táblázat. A vizsgálatban tesztelt methicillin-rezisztencia (MR) specifikus csúcsok

3.3.2. Korongdiffúziós módszer

A törzsek antibiotikum-rezisztenciájának vizsgálata során a CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) által meghatározott előírásoknak (2019) megfelelően jártunk el [25]. A 0,5 McFarland egységnyi baktérium-szuszpenziót Mueller-Hinton agar (Oxoid, UK) felületére szélesztettük, majd a táptalaj felületére helyeztük a Cefoxitin 30 μg korongokat. A törzseket 37 °C-on, 18 órán át inkubáltuk. Az MRSA törzsek esetében a feltisztulási zóna referencia tartománya 6-19 mm volt, míg mecA negatív fajoknál 20-32 mm.

3.3.3. Szelektív differenciáló agar

Az antibiotikum rezisztencia vizsgálatok során továbbá a CHROMagar MRSAII szelektív differenciáló táptalajt (BD, UK) alkalmaztunk, amely a methicillin-rezisztens Staphylococcus aureus fajok kimutatására szolgál. Az izolátumokat 37 °C-on 24-48 órán keresztül inkubáltuk aerob körülmények között. MRSA baktériumnak tekintettük azokat a törzseket, amelyek morfológiailag Staphylococcusokhoz hasonló mályvaszínű telepeket képeztek. A korongdiffúziós (Cefoxitin 30 µg) módszert és az MRSA CHROMagar vizsgálatot minden élelmiszerből izolált törzs (n=77) esetében kétszer ismételtük meg. A vizsgálatok során pozitív kontrollként az ATCC 33591 referencia MRSA törzset, negatív kontrollként pedig az ATCC 29213 MSSA törzset használtuk.

3.3.4. mecA génkomplex

A mecA gén kimutatásának vizsgálatát a Dán Nemzeti Élelmiszertudományi Intézet (National Food Institute – NFI) 2012-ben kiadott protokollja alapján végeztük el [26]. A vizsgálat során pozitív kontrollként az ATCC 43300 MRSA törzset, míg negatív kontrollként az ATCC 29213 MSSA törzset használtuk. A baktériumokból genomi DNS-t izoláltunk, majd a mecA génszakaszt PCR segítségével felszaporítottuk. Az alkalmazott primereket a 2. táblázat tartalmazza.

2. táblázat. A mecA gén felszaporításához alkalmazott primerek

3.4. A methicillin-rezisztens Staphylococcus törzsek MLST vizsgálata

THOMAS és munkatársai [27] tanulmánya alapján a baktériumokból genomi DNS-t izoláltunk, majd a 7 db Staphylococcus aureus fajra specifikus génszakaszt PCR segítségével felszaporítottuk (3. táblázat). Meghatároztuk a megtisztított PCR termékek nukleotid sorrendjét majd a szekvencia adatokat BioNumerics 7.6 szoftverben értékeltük.

3. táblázat. MLST módszer során alkalmazott gének és a felszaporításukhoz használt primerek adatai

4. Eredmények

4.1. Az izolált törzsek azonosítási eredményei

A MALDI-TOF-MS vizsgálat során minden koaguláz-pozitív Staphylococcus (CPS) törzs (n=47) S. aureus fajnak bizonyult (4. és 6. táblázat). A koaguláz-negatív Staphylococcus (CNS) törzsek esetében pedig 8 különböző fajt (S. xylosus, S. saprophyticus, S. pasteuri, S. epidermidis, S. warneri, S. chromogenes, S. piscifermentans, S. haemolyticus) azonosítottunk (4. és 7. táblázat). A CNS (n=30) izolátumok 30%-a S. warneri fajnak, míg 23%-a S. pasteuri fajnak bizonyult. A S. aureus törzsek 70%-át, míg a CNS törzsek mindegyikét hús és húskészítményekből izoláltuk (1. és 2. ábra). A S. aureus törzsek esetében a hús és húskészítmények 64%-a, míg a CNS törzsek 70%-a sertésből származott. A hús és húskészítményeken belül, a baromfiból és marhából származó izolátumok megoszlása közel azonos volt.

1. ábra. A S. aureus törzsek megoszlása élelmiszercsoportonként
2. ábra. A CNS törzsek megoszlása élelmiszercsoportonként

Az izolátumok átlag azonosítási log score értékeit és azok szórását a 4. táblázat foglalja össze. A S. aureus izolátumok átlag azonosítási log score értéke meghaladta a 2,400-et. A legalacsonyabb log score érték 2,304 volt, azonban még ebben az esetben is biztonságosnak tekinthető az azonosítás. A CNS izolátumok vizsgálata során, minden fajt 2,300 log score érték felett azonosítottunk és a szórás egyik esetben sem haladta meg a 0,1 értéket.

4. táblázat. Azonosított koaguláz-pozitív és -negatív Staphylococcus fajok azonosítási log score értékei

4.2. A MALDI-TOF-MS technikával meghatározott methicillin-rezisztencia eredményei

Az izolátumokból nyert tömegspektrumok elemzése során 3 antibiotikum-rezisztencia specifikus csúcsot vizsgáltunk meg. A 2414 m/z csúcs a mecA gén egyik fehérjeterméke [28], ezért ennek a csúcsnak a jelenlétét illetve hiányát minden törzs esetében megvizsgáltuk. A 7239 m/z csúcs detektálhatóságát csak a S. epidermidis fajokban, míg a 9674 m/z csúcs jelenlétét/hiányát csak a S. haemolyticus fajokban vizsgáltuk a csúcsok fajspecificitása miatt.

A 2414 m/z csúcsot a 77 izolátum közül, két S. aureus törzsben detektáltuk, amelyek közül az egyik libamájból (SA-17) a másik pedig sertés tarjából (SA-47) származik. A további 75 izolátum esetében ez a csúcs még alacsony intenzitással sem jelent meg (5. táblázat). Az elemzés során a methicillin-rezisztensnek bizonyult két S. aureus törzset pirossal, míg a többi, methicillin-rezisztencia specifikus csúcsot nem tartalmazó S. aureus törzsek tömegspektrumait feketével jelöltük (3. és 4. ábra).

A 7239 m/z egyik S. epidermidis törzsben (n=4) sem volt detektálható és a 9674 m/z csúcs a 4 S. haemolyticus faj egyikében sem jelent meg.

3. ábra. A 2414 m/z átmenet tömegspektruma
4. ábra. A 47 Staphylococcus törzs tömegspektruma
5. táblázat. Specifikus ion fragment-értékek előfordulási gyakorisága az élelmiszerekből izolált Staphylococcus törzsekben

4.3. A korongdiffúziós módszer és az MRSA CHROMagar szelektív differenciáló agar eredményei

A 77 törzs vizsgálata során 75 törzs esetében a feltisztulási zóna átmérője 23-29 mm közé esett. Egy libamájból izolált törzs (SA-17) feltisztulási zónája 9 mm, egy sertéstarjából izolált törzs (SA-47) feltisztulási zónája pedig 17 mm átmérőjű volt és ugyanezen törzsek mályvaszínű telepeket képeztek az MRSA CHROMagar szelektív differenciáló táptalajon is (6. és 7. táblázat).

6. táblázat. Az élelmiszerekből azonosított S. aureus törzsek antibiotikum rezisztencia vizsgálatok eredményei
7. táblázat. Az élelmiszerekből azonosított koaguláz-negatív Staphylococcus törzsek antibiotikum rezisztencia vizsgálatok eredményei

4.4. mecA gén kimutatás eredményei

A MALDI-TOF-MS vizsgálatok, a korongdiffúziós módszer és az MRSA szelektív, differenciáló táptalaj eredményei alapján kiderült, hogy a libamájból és sertés tarjából izolált S. aureus törzsek (SA-17, SA-47) methicillin-rezisztenciát hordoznak, amelyet a két törzsben kimutatható, a PBP2a szintéziséért felelős mecA gén erősített meg (6. táblázat).

4.5. Az MRSA törzsek MLST típusa

A vizsgálat során elvégeztük a két MRSA törzs MLST tipizálását is, amely során a PubMLST honlapon (https://pubmlst.org/saureus/) elérhető adatbázisban szereplő adatokat használtuk. A BioNumerics 7.6 szoftver a két MRSA törzs közül csak a sertés tarjából izolált törzs esetében tudta hozzárendelni a szekvencia típust.

A libamájból izolált törzs egy eddig még nem ismert szekvencia típusba, míg a sertés tarjából izolált törzs a 398-as szekvencia típusba tartozott (8. táblázat).

8. táblázat. Az élelmiszerekből izolált MRSA törzsek MLST típusa

5. Összefoglalás és következtetés

A vizsgálat során különböző élelmiszer mátrixokból 77 Staphylococcus izolátumot gyűjtöttünk az MSZ EN ISO 6888-1:2008 szabványban leírt módszerek alapján. A szabvány ugyan lehetővé teszi a koaguláz-pozitív és koaguláz-negatív Staphylococcus fajok elkülönítését, azonban a faji identifikálást nem, amely a fajok eltérő virulencia faktorai és patogenitása szempontjából számottevő. Az élelmiszerekből izolált 47 koaguláz-pozitív és 30 koaguláz-negatív Staphylococcus törzs azonosítását MALDI-TOF-MS technikával végeztük el, magas azonosítási log score értékekkel. Emellett a kapott tömegspektrumok elemzésével, korábbi tanulmányokban meghatározott methicillin-rezisztencia specifikus ion fragment-értékek alapján két S. aureus törzs esetében methicillin-rezisztenciát állapítottunk meg, amelyet korongdiffúziós módszerrel, szelektív differenciáló agarral és a mecA gén kimutatásával igazoltunk. A specifikus ion fragment értékeknek köszönhetően jelentősen csökkenthető a diagnosztikai idő, amely gazdasági és terápiás szempontból sem elhanyagolható. Azt azonban figyelembe kell vennünk, hogy az MRSA törzsek nagy variabilitásának köszönhetően ezeknek az ion fragment értékeknek a szenzitivitása és specificitása nem 100%-os, így megerősítő vizsgálatok elvégzése szükséges.

Az élelmiszerekből izolált két MRSA törzsnek elvégeztük a multilókusz szekvencia tipizálását (MLST), a törzsek epidemiológiai vizsgálata céljából. A sertéshúsból származó izolátum az ST398 típusba tartozott, amely a mezőgazdasági haszonállatokból izolált MRSA törzsek leggyakoribb típusa az EU/EGT területén. Figyelembe véve azonban az ST398-as típusú törzsek specifikus gazdaszervezet adaptációs képességeit, miszerint azok nem csak sertésekben, hanem más állatfajokban és a humán szervezetben is képesek megtapadni, a kontamináció és a fertőződés számos módon létrejöhet az élelmiszer-feldolgozás technológiai lépései során is.

Tekintve, hogy az élelmiszerekből izolált 47 S. aureus törzs közül 2 törzs is methicillin-rezisztensnek bizonyult, e tény igazolja a globálisan növekvő antibiotikum-rezisztencia okozta veszélyeket, ezáltal a helyzet súlyosságát és aktualitását is jelzi.

6. Köszönetnyilvánítás

A tanulmány a WESSLING Hungary Kft., a BIOMI Kft. és az Innovációs és Technológiai Minisztérium ÚNKP-19-3-III kódszámú Új Nemzeti Kiválóság Programjának szakmai támogatásával készült.

7. Irodalom

[1] Böröcz, K. (2001): A magyarországi nosocomialis MRSA járványok tapasztalatai (1993-2000). Epidemiológiai Információs Hetilap. 8. (10-11).

[2] Böröcz, K. (2005): Az Országos tisztifőorvos állásfoglalása a methicillin-rezisztens Staphylococcus aureus (MRSA) törzsek által okozott, egészségügyi ellátással összefüggő fertőzések megelőzésükről és terjedésük megakadályozásáról. Epidemiológiai Információs Hetilap. 12. (5).

[3] Jungwhan, C., Kidon, S., Saeed, K. (2017): Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in Food-Producing and Companion Animals and Food Products. Frontiers in Staphylococcus aureus. Intechopen.

[4] Lim, D., Strynadka, N. C. J. (2002): Structural basis for the β-lactam resistance of PBP2a from metichillin-resistant Staphylococcus aureus. Nature Structural Biology. 9 (11), pp. 870-876. https://doi.org/10.1038/nsb858

[5] Ito, T., Katayama, Y., Hiramatsu, K. (1999): Cloning and nucleotide sequence determination of the entire mec DNA of pre-methicillin-resistant Staphylococcus aureus N315. Antimicrob Agents Chemother. 43 (6), pp. 1449-58. https://doi.org/10.1128/AAC.43.6.1449

[6] Wielders, C. L., Vriens, M. R., Brisse, S., De Graaf-Miltenburg, L. A., Troelstra, A., Fleer, A., Schmitz, F. J., Verhoef, J., Fluit, A. C. (2001): In-vivo transfer of mecA DNA to Staphylococcus aureus [corrected]. Lancet. 26; 357 (9269), pp. 1674-1675. https://doi.org/10.1016/S0140-6736(00)04832-7

[7] Köck, R., Harlizius, J., Bressan, N., Laerberg, R., Wieler, L. H., Witte, W., Deurenberg, R. H., Voss, A., Becker, K., Friedrich, A. W. (2009): Prevalence and Molecular Characteristics of Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA) Among Pigs on German Farms and Import of Livestock-Related MRSA Into Hospitals. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 28 (11), pp. 1375-1382. https://doi.org/10.1007/s10096-009-0795-4

[8] Agersø, Y., Hasman, H., Cavaco, L. M., Pedersen, K., Aarestrup, F. M. (2012): Study of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in Danish pigs at slaughter and in imported retail meat reveals a novel MRSA type in slaughter pigs. Veterinary Microbiology. 157 (1-2), pp. 246-250. https://doi.org/10.1016/j.vetmic.2011.12.023

[9] Argudín, M. A., Tenhagen, B. A., Fetsch, A., Sachsenröder, J., Käsbohrer, A. (2011): Virulence and resistance determinants of German Staphylococcus aureus ST398 isolates from nonhuman sources. Applied and Environmental Microbiology. 77 (9), pp. 3052-3060 https://doi.org/10.1128/AEM.02260-10

[10] Juhász-Kaszanyitzky, E., Jánosi, S., Somogyi, P., Dán, A., Van Der, A., Graaf-Van Bloois, L. (2007): MRSA transmission between cows and humans. Emerging Infectious Diseases. 13 (4), pp. 630-632. https://doi.org/10.3201/eid1304.060833

[11] Albert, E., Sipos, R., Jánosi, Sz., Kovács, P., Kenéz, Á., Micsinai, A., Noszály, Zs., Biksi, I. (2020): Occurrence and characterisation of methicillin-resistant Staphylococcus aureus isolated from bovine milk in Hungary. Acta Veterinaria Hungarica. 68 (3) pp. 236-241. https://doi.org/10.1556/004.2020.00040

[12] Wendlandt, S., Schwarz, S., Silley, P. (2013): Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus: A Food-Borne Pathogen? Annual Review of Food Science and Technology. 4, pp. 117-139. https://doi.org/10.1146/annurev-food-030212-182653

[13] Bosch, T., Verkade, E., Van Luit, M., Landman, F., Kluytmans, J., Schouls, L. M. (2015): Transmission andpersistence of livestock-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus among veterinarians and their household members. Applied and Environmental Microbiology. 81 (1), pp. 124-129. https://doi.org/10.1128/AEM.02803-14

[14] Fluit, A.C. (2012): Livestock-associated Staphylococcus aureus. Clinical Microbiology and Infection. 18 (8), pp. 735-744. https://doi.org/10.1111/j.1469-0691.2012.03846.x

[15] Verkade, E., Van Benthem, B., Den Bergh, M. K., Van Cleef, B., Van Rijen, M., Bosch, T., Kluytmans, J. (2013): Dynamics and determinants of Staphylococcus aureus carriage in livestock veterinarians: a prospective cohort study. Clinical Infectious Diseases. 57 (2), pp. 11-17. https://doi.org/10.1093/cid/cit228

[16] Fowoyo, P. T. - Ogunbanwo, S. T. (2017): Antimicrobial resistance in coagulase-negative staphylococci from Nigerian traditional fermented foods. Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials, 16 (4), pp. 2-7. https://doi.org/10.1186/s12941-017-0181-5

[17] Chaje, W., Zadernowska, A. C.-W., Nalepa, B., Sierpinska, M., - Łaniewska-Trokenheim, L. (2015): Coagulase-negative staphylococci (CoNS) isolated from ready-to-eat food of animal origin e Phenotypic and genotypic antibiotic resistance. Food Microbiology, 46, pp. 222-226. https://doi.org/10.1016/j.fm.2014.08.001

[18] European Food Safety Authority - EFSA (2018): The European Union summary report on antimicrobial resistance in zoonotic and indicator bacteria from humans, animals and food in 2016. EFSA journal. 16 (2), pp. 5182. https://doi.org/10.2903/j.efsa.2018.5182

[19] Aires-De-Sousa, M. (2016): Methicillin-resistant Staphylococcus aureus among animals: current overview. Clinical Microbiology and Infection. 23, pp. 373-380. https://doi.org/10.1016/j.cmi.2016.11.002

[20] Josten, M., Dischinger, J,. Szekat, C., Reif, M., Al-Sabti, N., Sahl, H. G., Parcina, M., Bekeredjian-Ding, I, Bierbaum, G. (2014): Identification of Agr-Positive Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus Harbouring the Class A Mec Complex by MALDI-TOF Mass Spectrometry. International Journal of Medical Microbiology. 304 (8), pp. 1018-1023. https://doi.org/10.1016/j.ijmm.2014.07.005

[21] Alksne, L., Makarova, S., Avsejenko, J., Cibrovska, A., Trofimova, J., Valciņa, O. (2020): Determination of methicillin-resistant Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis by MALDI-TOF-MS in clinical isolates from Latvia. Clinical Mass Spectrometry. 16, pp. 33-39. https://doi.org/10.1016/j.clinms.2020.03.001

[22] Pranada, A. B. - Bienia, M. - Kostrzewa, M. (2016): Optimization and Evaluation of MRSA Detection by Peak Analysis of MALDI-TOF Mass Spectra, in DGHM 2016 https://www.msacl.org/view_abstract/MSACL_2017_EU.php?id=305 Hozzáférés: 2021.01.08.

[23] Manukumar, H. M., Umesha, S. (2017): MALDI-TOF-MS based identification and molecular characterization of food associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Scientific Reports. 7, 11414 pp. 1-16. https://doi.org/10.1038/s41598-017-11597-z

[24] Horvath, B., Peles, F., Szél, A., Sipos, R., Erős, Á., Albert, E., Micsinai, A. (2020): Molecular typing of foodborne coagulase-positive Staphylococcus isolates identified by MALDI-TOF-MS. Acta Alimentaria, An International Journal of Food Science. 49 (3), pp. 307-313. https://doi.org/10.1556/066.2020.49.3.9

[25] Clinical and Laboratory Standards Institute - CLSI (2019): Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing: Eighteenth Informational Supplement M100- S18. Wayne, PA, USA: CLSI.

[26] National Food Institute - NFI (2012): protocol for pcr amplification of meca, mecc (mecalga251), spa and pvl recommended by the eurl-ar 2st version. https://www.eurl-ar.eu/CustomerData/Files/Folders/21-protocols/279_pcr-spa-pvl-meca-mecc-sept12.pdf Hozzáférés: 2021.02.03.

[27] Thomas, J. C., Vargas, M. R., Miragaia, M., Peacock, S. J., Archer, G. L., Enright, M. (2007): Improved Multilocus Sequence Typing Scheme for Staphylococcus epidermidis. Journal of Clinical Microbiology. 45 (2), pp. 616-619. https://doi.org/10.1128/JCM.01934-06

[28] Josten, M., Dischinger, J,. Szekat, C., Reif, M., Al-Sabti, N., Sahl, H. G., Parcina, M., Bekeredjian-Ding, I, Bierbaum, G. (2014): Identification of Agr-Positive Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus Harbouring the Class A Mec Complex by MALDI-TOF Mass Spectrometry. International Journal of Medical Microbiology. 304 (8), pp. 1018-1023. https://doi.org/10.1016/j.ijmm.2014.07.005

Tovább a cikk olvasásához


A magyar fogyasztók krónikus aflatoxin M1 expozíciója

Cikk letöltése PDF formátumban

A magyar fogyasztók krónikus aflatoxin M1 expozíciója

DOI: https://doi.org/10.52091/EVIK-2021/2-2-HUN

Érkezett: 2021. március – Elfogadva: 2021. május

Szerzők

1 Nemzeti Élelmiszerlánc-biztonsági Hivatal, Rendszerszervezési és Felügyeleti Igazgatóság
2 Állatorvostudományi Egyetem, Digitális Élelmiszerlánc Oktatási, Kutatási, Fejlesztési és Innovációs Intézet
3 Debreceni Egyetem, Táplálkozás- és Élelmiszertudományi Doktori Iskola

Kulcsszavak

determinisztikus expozícióbecslés, krónikus aflatoxin M1 expozíció, veszélyeztetett fogyasztói csoportok, karcinogén hatás, májrák kialakulásának veszélye

1. Összefoglalás

A takarmányok mikotoxin szennyezettsége megjelenik az élelmiszerláncban. Az aflatoxinok az állatok szervezetében metabolizálódnak és metabolitjuk, az aflatoxin M1 (AFM1) – amely az aflatoxin B1-hez (AFB1) hasonlóan, de annál tízszer kisebb mértékben genotoxikus és rákkeltő – megjelenik a tejben, a májban, valamint a tojásban is. Ezek közül a legjelentősebb élelmiszerbiztonsági kockázatot a tej AFM1 szennyezése jelenti. Cikkünkben bemutatjuk a magyar fogyasztók tej és tejtermékek AFM1 szennyezése alapján determinisztikus módszerrel számított expozícióbecslését. Az eredmények azt jelzik, hogy a három évnél fiatalabb gyerme-kek kitettsége egyértelműen egészségügyi kockázatot jelent, a 3-6 éves korcsoport expozíciója pedig határeset. Az idősebb korcsoportok ng/testtömeg kg-ban kifejezett expozíciója a növekvő testtömeg következtében közvetlen egészségügyi kockázatot nem jelent. Hangsúlyozzuk azonban, hogy a rákkeltő vegyületek jelenlétét minden korcsoportban a lehető legalacsonyabb szinten kell tartani. Ennek érdekében a tej üzemi ellenőrzésének rendeleti módosítását javasoljuk.

2. Bevezetés

A mikotoxin-szennyezéssel foglalkozó előző közleményünkben bemutattuk a hazai élelmiszerek és takarmányok mikotoxin-szennyezettségét, azok eltűrhető maximális koncentrációjának jogi szabályozását, a mintavételi eljárások korlátait és elemeztük a jelenlegi hazai gyakorlat tapasztalatait [1]. A 2009-ben végrehajtott élelmiszerfogyasztási felmérés adatait és a 2010-2018 időszakból rendelkezésünkre álló mérési eredményeket felhasználva becsültük a magyar fogyasztók expozícióját DON és aflatoxin M1 vonatkozásában. Előzetes becsléseink alapján megállapítottuk, hogy a fogyasztók egy részénél az aflatoxin M1 és a DON expozíciója az élelmiszerek szennyezésének évenként változó szintje miatt időszakonként meghaladhatja a toxikológiai referencia-értékeket, és ez humánegészségügyi kockázatot jelenthet.

Jelen közleményünkben bemutatjuk az újabb analitikai mérési eredmények és a 2018-2019 folyamán az Európában egységesen alkalmazott metodikával végrehajtott, magyar élelmiszerfogyasztási felmérés adatainak felhasználásával, determinisztikus módszerrel elvégzett számításaink eredményét, amely a különböző fogyasztói korcsoportok krónikus AFM1 expozíciójáról ad információt.

A mikotoxintermelő gombáknak a globális felmelegedés következtében várható terjedése, az általuk termelt toxinok okozta élelmiszer és takarmány szennyezettségi szintek növekedése, a nekik tulajdonítható egészségügyi problémák és gazdasági károk intenzív kutatómunkát indukáltak. Az eredményeket ismertető nagyszámú közleményt a rendszeresen közreadott összefoglaló cikkek kutatási területenként teszik könnyeben áttekinthetővé, mint például a mikotoxint termelő Aspergillus fajok kölcsönhatása a talaj mikroorganizmusaival [2], a mikotoxin expozíció humán fiziológiai hatásai [3], biokontroll technológiák alkalmazása az aflatoxin szennyezés csökkentésére, a silókészítési technológia és mikrobióta hatása az aflatoxin szennyezésre [4], a mikotoxin-szennyezés forrásai, előfordulása, szabályozása [5, 6], detektálási módszerei [7]. A Frontiers in Microbiology folyóirat 22 legújabb kutatási eredményt, összefoglalót tartalmazó különkiadását könyv formájában is megjelentette [8].

A fenti kiadványokra való tekintettel alábbiakban csak a közleményünk célkitűzéséhez szorosan tartozó szakirodalmi közleményeket foglaljuk össze.

2.1. Az aflatoxinok előfordulása

A nyers mezőgazdasági termékekben (elsősorban földimogyoró, kukorica, rizs, diófélék, füge, fűszerek, szárított gyümölcsök), takarmányokban előforduló aflatoxinok és egyéb mikotoxinok bekerülnek az élelmiszerláncba és detektálhatók tejben [9, 10, 11, 12], tojásban, húsban, belsőségekben [6, 13]. Aflatoxikolt detektáltak broiler és tojó tyúkok májában, veséjében és húsában [14, 15]. Az AFB1-nek a takarmányban lévő koncentrációjához viszonyítva a tyúkok májában, tojássárgájában és a tojásfehérjében >5700-, >4600-, >3800-szoros koncentrációkat mértek [16].

A takarmányból a tejbe jutó AFM1 koncentrációja az állatok AFB1 (µg/ttkg) kitettségén túlmenően számos tényezőtől függ, mint például a tehén egészségi állapota, tejhozama, a laktációs időszak stb. [17]. A nagy tejhozamú egyedek esetén az átviteli arány nagyobb [18]. A szakirodalomban számos vizsgálat eredményét közölték, amelyek szerint az átviteli arány kerekítve 0,35-6% között változott. Juhokban alacsonyabb (0,08%-0,33%) átviteli arányt tapasztaltak [19].

Az aflatoxin májba, húsba és tojásba történő átvitele kapcsán kevesebb kutatási eredmény áll rendelkezésre, azonban ezek a tejhez képest jelentősen kisebb átviteli arányról számolnak be, így továbbra is a tej tekinthető az állati eredetű élelmiszerek között a legjelentősebb aflatoxin-forrásnak [4, 20].

Az AFB1-gyel szennyezett élelmiszer fogyasztásakor a tehéntejhez hasonló mértékben kerül AFM1 az anyatejbe is [21, 22, 23, 24, 25, 26]. A tehéntej alapú tápszerrel, tejitalokkal táplált csecsemők és kisgyermekek szintén AFM1-expozíciónak lehetnek kitéve. Az európai felmérések eredményei jóval alacsonyabb expozíciós szintet jeleznek, mint az afrikai és az ázsiai publikációk [27].

Mint minden mikotoxin esetében, az aflatoxinoknál is megfigyelhető, hogy szintjük jelentős éves ingadozást mutat a gombák növekedését és a toxintermelést befolyásoló időjárási viszonyoktól függően [28].

Az EFSA a legutóbbi kockázatbecsléséhez [29] a tagországok által 2013 után jelentett aflatoxin M1 mérési eredményeket használta fel. Néhány fontosabb élelmiszer-kategóriára vonatkozó statisztikai adatot a 1. táblázatban foglaltunk össze.

1. táblázat. AFM1 átlag és 95. percentilis koncentráció értékek az EFSA 2013-2020-as tagországi adatai alapján.

Megjegyzés:

N: mérési eredmények száma; % LCD (left censored data): kimutatási/mérési határ alatti eredmények aránya; P95: 95. percentilis; LB: lower bound - a legkisebb koncentrációval történő behelyettesítés eredménye; UB: upper bound - a legnagyobb koncentráció értékkel történő behelyettesítés eredménye; Egyéb: csecsemőknek és kisgyermekeknek szánt élelmiszerek.

2.2. Az aflatoxinok egészségügyi hatásai

Az aflatoxinok (különösképpen az AFB1, az AFG1 és az AFM1) valamennyi kísérleti állatfajban, például halak, kacsák, egerek, patkányok, majmok esetében rendkívül erős karcinogén, vese- és májkárosító, genotoxikus, fejlődési rendellenességet okozó, szaporodási képességet csökkentő, immunszupresszív és idegrendszeri károsító vegyületnek bizonyultak [30]. Egy a közelmúltban közölt vizsgálat kimutatta, hogy a patogén gombák spórái a különböző madarak szervezetében súlyos, fatális fertőzést okoznak [31].

Az AFB1 nagy mennyiségben – mind emberek, mind állatok esetében – gyors lefolyású, akut mérgezést is okozhat, amely során a kialakuló súlyos májelégtelenség akár halálhoz is vezethet, ennek humán kockázata azonban a fejlett országokban elhanyagolható. Az aflatoxinok közül az aflatoxin B1 a legerősebb rákkeltő, genotoxikus vegyület, ez fordul elő leggyakrabban élelmiszerekben és takarmányokban. Legtöbbször hepatocelluláris karcinómát (HCC) okoz, ezért az IARC az AFB1-et az emberekre nézve rákkeltő, 1. csoportba sorolta. A tejelő tehenek AFB1-gyel szennyezett takarmány fogyasztását követően annak hidroximetabolitját, az aflatoxin M1-et választják ki a tejbe, amely szintén karcinogén vegyület, bár toxicitása körülbelül egytizede az AFB1-ének [32, 33].

Az aflatoxinok gyorsan és nagy arányban szívódnak fel a vékonybélben, majd a májba kerülve, az ott található citokróm P450 enzimrendszer katalizálja az aflatoxin metabolizmusát. Az AFB1, AFG1 és az AFM1 olyan reaktív elektrofil epoxiddá alakul, amely kovalensen képes kötődni mind a DNS-hez, mind a fehérjékhez. Ugyanakkor a glutation-S-transzferázok (GST) az AFB1 8,9-exo epoxiddal olyan konjugációs kapcsolatot képesek kialakítani, amely már így nem tud a szervezetben káros reakcióba lépni, és az epén és a vesén keresztül ürül. Az egyének közötti polimorfizmusok nagy variabilitást eredményeznek az enzimatikus folyamatok terén, ezáltal az aflatoxinnal szembeni érzékenység is egyéni eltéréseket mutat [30, 34, 35].

Az aflatoxin metabolitok nagy része optimális esetben pár nap alatt ürül ki a szervezetből, azonban megfigyelték, hogy fehérjéhez kötött formában (például aflatoxin-albumin adduktok esetében) hosszabb távon jelen van a perifériás keringésben, ahol 30-60 napos felezési idővel kell számolni [36].

Az aflatoxinok közvetlenül, illetve közvetve is, a lipid-metabolizmushoz kapcsolódó gének expressziójának megváltoztatásával károsítják a májsejteket. A megnövekedett koleszterin-, triglicerid- és lipoprotein-termelés a hepatociták szétesését okozhatja. A hepatociták pusztulása akut hepatitishez vezethet, amely májelégtelenséget, súlyosabb esetben halált eredményezhet. A hepatitisben szenvedő betegek felborult metabolizmusa következtében alultápláltság alakulhat ki, ez pedig közvetve hozzájárul a hepatociták antioxidáns kapacitásának általános csökkenéséhez, a májszövet regenerálódási képességének elvesztéséhez, végül pedig májelégtelenséghez vezethet [3].

Az EFSA szakértőinek állásfoglalása alapján az aflatoxinok kockázatbecslésének sarkalatos pontja annak értékelése, hogy ezeknek a toxinoknak mekkora szerepük van a májrák kialakulásában. Ebből a szempontból különösen érzékenyek az aflatoxinokra a gyermekek, akiknek kis testtömegük miatt magasabb az egy testtömeg kg-ra jutó élelmiszer bevitele, illetve magasabb a májrák kialakulásának kockázata a hepatitisz B (vagy C) vírussal fertőzött egyének és az idősek esetében. Az olyan területeken élő emberekben, ahol a hepatitis B vírus (HBV) fertőzés és az aflatoxin expozíció is gyakori, a hepatocelluláris karcinoma-minták (HCC-minták) mutációs (G-T transzformációt) hotspotot mutatnak a p53 gén 249. kodonjánál, amely mutációt az aflatoxin által kiváltott HCC ismertetőjelének tartanak [37]. Ennek valószínűsíthető oka, hogy a máj hepatitisz-fertőzése megváltoztatja az aflatoxinokat méregtelenítő enzimeket kódoló gének expresszióját eredményezi – például a CYP enzimek indukcióját vagy a GST aktivitásának csökkenését okozza –, ezáltal a szervezet nem képes az aflatoxinok megfelelő mértékű eliminációjára [35]. Az aflatoxinok immunszupressziv hatása miatt kiemelten veszélyeztettek a krónikus betegségben szenvedő idős személyek, mert az ő esetükben a sejtszintű javító mechanizmusok hatékonysága rosszabb, így az aflatoxinok eliminációja is alacsonyabb hatékonyságú. Kiemelendő, hogy az aflatoxin átjut a placentán, tehát a várandós nők aflatoxin expozíciója veszélyeztetheti a magzatot is [38].

2.3. A feldolgozás hatása az élelmiszerek aflatoxin tartalmára

Az aflatoxinok közös jellemzője, hogy stabilak, a feldolgozási hatásokkal, hőhatásokkal szemben ellenállók. Ennek következménye, hogy jelenlétükkel a feldolgozott élelmiszerek esetében is számolni kell. Bizonyos feldolgozási lépések csökkenthetik a termények és a feldolgozott élelmiszerek mikotoxin koncentrációját például válogatás, tisztítás, őrlés, főzés, sütés, olajban sütés, pörkölés, konzerválás, pelyhesítés, lúgos főzés, nixtamalizáció (maghéj puhítása fahamu vagy Ca-hidroxid használatával – a szerk.), extrudálás, fermentálás, de nem elegendőek ahhoz, hogy az összes szennyeződést eliminálják, ezért kiemelkedően fontos a megelőzés szerepe az élelmiszerlánc legelső pontjain [20]. Az AFM1 szennyezés szempontjából lényeges például a takarmányok AFM1 szennyezettségének csökkentése betakarítás előtti és utáni biotechnikai módszerek, valamint toxinkötők alkalmazásával [4, 17].

A hőkezeléssel járó eljárások közül a hagyományos főzésnek és a sütésnek csekély hatása van a mikotoxin szennyezettségre, míg a magasabb hőmérsékleti tartományban végzett, esetleg száraz hőt is alkalmazó módszerek [39] hatékonyabbak. A mikotoxinok bomlását fokozza a cukrok, például a glükóz jelenléte hőkezelés során [40].

A gabonafélék, például a kukorica nedves őrlése során az aflatoxin a következő arányban oszlik meg az őrlési frakciók között: áztató víz: 39-42%, rost: 30-38%, glutén: 13-17%, csíra, 6-10% és keményítő: 1%. Tehát a feldolgozott termékek összes aflatoxin szintje az áztató vízbe jutó hányaddal csökken. A kukorica száraz őrlése után a dara-, a korpa- és a lisztfrakciók az eredeti aflatoxin-mennyiség mindössze 6-10%-át tartalmazzák, a csíra- és a héjfrakciókba jut a legtöbb aflatoxin [20].

A rizs aflatoxin-szennyezése leggyakrabban a helytelen betakarítási, tárolási körülmények során alakul ki. A mikotoxinok elsősorban a rizs héjában és a korparétegben találhatók. A hántolt barna rizs és a koptatással nyert fehér rizs a koptatás mértékével fokozatosan kisebb mértékben szennyezett [41].

A különböző hőkezelési eljárások, a pasztörizálás, a fagyasztás nincs számottevő hatással a tej, illetve tejtermékek aflatoxin tartalmára [42]. Néhány hőkezelési eljárás AFM1 csökkentő hatása számszerű értékekkel kifejezve: pasztörizálás: 7,6-12,9%-kal, forralás: 14,5-23,9%-kal [43], az UHT-kezelés: 32%-kal csökkenti a tej AFM1-szennyezettségét [44].

A tej vagy más folyékony halmazállapotú termékek AFM1 tartalmának csökkentésére különböző fizikai és kémiai eljárásokat alkalmaztak jó hatásfokkal: mikrohullámú sugárzás (52%) [43], membránszűrés (81%) [45], bioszűrés (81%) [46] centrifugálás és szűrés kombinációja (83%) [45], ózonos kezelés [47], adszorbensek használata (85-90%) [48, 49].

Intenzív kutatómunka folyik a mikroorganizmusok felhasználásával kapcsolatban. Biztató eredményt kaptak AFM1 szennyezettségének csökkentésére tejben Saccharomyces cerevisiae (90-93%) [50], S. cerevisise + L. rhamnosus, L. delbrueckii spp. bulgaricus, B. lactis (100%) [49], különböző élesztőgombák keveréke (65-69%) [51], hőkezelt L. plantarum (94,5%) [44], L. bulgaricus (58%) [52] és joghurtban S. thermophilus, L. bulgaricus és L. plantrium törzsek [53] alkalmazásával. Élő mikrobák használata esetén megoldásra vár, hogy miként küszöbölhető ki az organoleptikus tulajdonságok kedvezőtlen megváltozása, amennyiben nem a hagyományos kultúrákat használják, és milyen módon távolítható el a termékből a kialakult tejsavbaktérium-AFM1 komplex [44].

3. A fogyasztók expozíciójának becsléséhez felhasznált adatok

Az expozíciót (g/ttkg vagy ng/ttkg) a fogyasztott élelmiszer (g/ttkg) és a benne mért szennyezőanyag koncent-rációk (ng/kg) szorzata adja. A determinisztikus módszernél az átlagos (medián), esetenként egy felső per-centilis (95,0; 97,5) értékeket szorozzuk össze. A számítás pontszerű becslést ad egy-egy konkrét értéket eredményezve [54, 55]. Finomabb becslést adnak a probabilisztikus módszerek [56, 57], amelyeknél a bemenő adatok eloszlását vesszük figyelembe és így az expozícióra is egy eloszlást kapunk. Körültekintést érdemel a kimutatási határ (LOQ) alatti vizsgálati eredmények értékelése. Amennyiben az LOQ alatti minták aránya 50-80% közé esik, a „maximum likelihood becslés” (maximum likelihood estimate, MLE) adja a legjobb eredményt [58].

Bármelyik módszerrel történjen is a becslés, mindenképpen fontos számba venni az egyes számítási lépések bizonytalanságát, azok mértékét és ezek összesített hatásának tükrében értékelni a kapott eredményeket [59]. A számított bizonytalansági intervallum egy bizonyos konfidenciaszinttel, vagyis adott bizonyossággal valószínűsíthető módon magában foglalja a valós értékeket [60]. A fogyasztó szervezetébe jutó szennyező-anyag-mennyiséget (EDI) a toxikológiai referencia érték(ek)hez hasonlítva állapítjuk meg a várható egészség-ügyi kockázat mértékét.

Mind a rövid, mind a hosszú távú expozícióbecslésnél érdemes megvizsgálni az adott élelmiszer-szennyező kombináció fogyasztásának szempontjából különösen érintett fogyasztói csoportokat, azon belül pedig összehasonlítani az átlagos fogyasztók és a „nagy fogyasztók” expozícióját [61].

3.1. Referencia értékek a kitettség értékeléséhez

A referencia érték a szennyező specifikus tulajdonságai szerint lehet a megengedhető napi bevitel (ADI, Acceptable Daily Intake), ideiglenesen tolerálható heti vagy havi bevitel (PTW/MI, Provisionally Tolerable Weekly/Monthly Intake), vagy akut referencia dózis (ARfD, Acute Reference Dose). Élelmiszerszennyezők esetén a referencia érték általában a tolerálható napi bevitel (TDI, tolerable daily intake). A küszöbérték (BMD, benchmark dose) az a legkisebb dózis nagyság, amelyet az illesztett dózis-hatás görbéből becsülnek, és amelyen egy előre kiválasztott hatásszint (ez a benchmark response – BMR) megfigyelhető, ami általában 5 vagy 10%-os emelkedést vagy csökkenést jelent a kontroll csoporthoz képest. A BMD alsó konfidencia értéke a BMDL [62]. Az aflatoxinok esetében az expozíciós tűréshatár (MoE, Margin of Exposure) elemzése használatos a kockázat jellemzésére, mivel nem állapítható meg TDI vagy más toxikológiai referencia érték. Ilyen esetben a BMDL bizonytalansági faktorral módosított értékét viszonyítjuk a becsült kitettséghez. A szennyezőnek tulajdonítható kockázat a kitettség mértékének egyéb referencia értékhez viszonyított arányával is kifejezhető, ez a veszélyességi hányados (HQ, Hazard Quotient), vagy a veszélyességi index (HI, Hazard Index), amely ugyanazon célszervre vagy szervrendszerre ható anyagok veszélyességi hányadosainak összege. Általában kumulatív becsléseknél alkalmazzák [63].

Az EFSA a 4 μg/ttkg/nap BMDL10 érték használatát javasolja viszonyítási pontnak az AFM1 kockázat jellemzéshez [29]. A kapott eredmények 10 000 alatt számítanak aggályosnak, a 10 000 vagy annál nagyobb MoE közegészségügyi szempontból csekély kockázatra utal.

Az AFM1 kockázatának jellemzésére, a veszélyességi index (HI) számításához a Kuiper-Goodmann által javasolt biztonságos dózis is alkalmazható (0,2 ng/ttkg/nap), amely az állatok 50%-ánál tumort okozó dózis és egy 50 000-es biztonsági faktor hányadosa [64].

A JECFA 2018-as számításai szerint [20] napi 1 ng/ttkg AFB1 bevitel esetén a májrák-kialakulás valószínűsége átlagosan 0,269 évente. 100 000 személyre vonatkoztatva a becslés 95%-os konfidencia intervallumának felső határa pedig 0,562/100 000 fő/év HBsAg+ (hepatitis B felszíni antigénre nézve pozitív) egyéneknél. HBsAg- (hepatitis B felszíni antigén-negatív) egyéneknél az átlag érték 0,017 rákos megbetegedés/év/100 000 fő, a becslés 95%-os konfidencia intervallumának felső határa 0,049/100 000 fő/év. Az AFM1-re vonatkozó becsült átlag értékek ennél egy nagyságrenddel alacsonyabbak: 0,027/100 000 fő HBsAG-pozitív, illetve 0,002/100 000 fő ng/ttkg/nap HBsAg-negatív egyének esetén [20].

A JECFA az aflatoxin expozícióval összefüggő hepatocelluláris carcinoma (HCC) kockázatát az 1. egyenlet felhasználásával becsülte meg:

Ri = [(PHBV+ × HBV+) + (PHBV− × (1–HBV+))] x AF bevitel (1),

ahol Ri az i régióra vonatkozó HCC kockázat, HBV+ a vizsgált populációban a krónikus hepatitis B prevalenciája és PHBV+ a májrák kialakulásának a populáció e hányadára vonatkozó valószínűsége, PHBV- pedig a populáció fennmaradó részében a májrák kialakulásának a valószínűsége.

3.2. Élelmiszerfogyasztási adatok

A számításokat két, 10 év különbséggel készült országos, reprezentatív élelmiszerfogyasztási felmérés adataival végeztük. A 2009. évi három napos felmérés során 4992 személy esetében összesen 14 976 fogyasztási nap – dietetikusok által feldolgozott és nyersanyagra lebontott – élelmiszerfogyasztási adatait szolgáltatja az élelmiszerfogyasztási szokások jellemzéséhez [65]. A tej és tejtermék fogyasztási napok arányát az 1. ábra mutatja.

A 2009-es felmérés 14 976 fogyasztási napjából a tej-, tejföl-, tejszín-, sajt-, kefir- vagy joghurtfogyasztás gyakorisága [%] rendre 75,2, 52,8, 46,3, és 19,1 volt.

A 2018-2020-as felmérés az EFSA egész Európára kiterjedő EU MENU, avagy „Mi van terítéken Európában?” projektjének keretében az ajánlott, egységes módszertannak megfelelően valósult meg [66, 67]. A résztvevő személyeket a KSH Háztartási költségvetési- és életkörülmények adatfelvételben résztvevő háztartásokból választották ki. A program során 2657, 1 és 74 év közötti személy két fogyasztási napját rögzítették dietetikusok segítségével. Az 5314 fogyasztási napon a tej-, tejföl-, tejszín-, sajt-, kefir- vagy joghurtfogyasztás gyakorisága [%] 96,8, 54, 60,6 és 24 volt. A tej és tejtermék fogyasztási napok arányát a 2. ábra mutatja.

1. ábra. A 2009-es felmérésben a tej és tejtermék fogyasztási napok aránya élelmiszercsoportonként
2. ábra. 2018-2020-as felmérésben a tej és tejtermék fogyasztási napok aránya élelmiszercsoportonként

A fogyasztók korcsoportonkénti megoszlását a 2. táblázat tartalmazza.

2. táblázat. A 2009-es és a 2018-2020-as élelmiszerfogyasztási felmérés korcsoportjai és a tejterméket fogyasztók száma és aránya korcsoportonként

A tej és a különböző tejtermékek fogyasztási gyakoriságának változását a 2009-es és a 2018-2020-as élelmiszerfogyasztási felmérések tej és tejtermék fogyasztási napjainak segítségével hasonlítottuk össze. A különböző élelmiszerek fogyasztási napjainak számát az adott felmérés összes fogyasztási napjához viszonyítottuk (3. ábra). Az ábra a vizsgált felmérési időszakokban a különböző élelmiszerek fogyasztásának előfordulási gyakoriságát jellemzi. A vizsgált élelmiszerkategóriák közül a tej és a tejalapú desszertek fogyasztási gyakorisága több mint 20%-kal nőtt. A sajtok fogyasztási gyakorisága 14%-os emelkedést mutatott. A savanyított tejtermékek (kefir, joghurt, tejföl), a tejszín és az ízesített tejek fogyasztási gyakorisága közel állandó maradt (előbbiek kissé nőttek, utóbbiak némileg csökkentek). A sűrített tej és tejpor fogyasztási gyakorisága jelentősen csökkent. Összességében megállapítható, hogy a tej és tejtermékek fogyasztási gyakorisága az elmúlt 10 év alatt kissé emelkedett.

A fogyasztási gyakoriságok 10 év alatt bekövetkező változásából kiindulva az aflatoxin expozíció növekedésére lehetne számítani, azonban ezt a hatást a fogyasztási mennyiségek változása ellensúlyozta. A feldolgozási és a feldúsulási faktorok medián értékével számított, tej ekvivalensben kifejezett átlagos fogyasztási mennyiség 2009-ben még 310,7 g/nap volt, ez az érték 2018-2020-ban 295,3 g/napra csökkent.

3. ábra. A fogyasztási napok aránya az összes fogyasztási naphoz viszonyítva; A különböző élelmiszercsoportok fogyasztási gyakoriságának változása a 2009-es és a 2018-2020-as élelmiszerfogyasztási felmérés eredményei alapján

A feldolgozott tejtermékekben az AFM1 koncentrációkra nagyon kevés adat állt rendelkezésre, ezért a savanyított tejtermékekre (például kefir, joghurt, tejföl), valamint a különböző sajtokra (kemény, félkemény, lágy és feldolgozott sajtok, friss sajtok) vonatkozó AFM1 feldolgozási és feldúsulási faktorok adatbázisát a legfrissebb szakirodalmi adatok alapján összeállítottuk és ezen termékek fogyasztott mennyiségeinek tej ekvivalensével számítottuk a fogyasztók expozícióját.

3.3. Aflatoxin koncentráció adatok

Az AFM1 vizsgálati adatok részben a NÉBIH 2011-2020 közötti országos monitoring felméréséből származnak (1288 db). A minták 40%-a tartalmazott mérhető mennyiségű AFM1-et. A mérések zömét tejtermelő gazdaságok és magántermelők termékéből, kis arányban pedig boltokban kapható elegytejből vett mintákból, ELISA és HPLC módszerrel végezték. A nagyszámú LOQ alatti (60%) szennyezést mutató tételek mellett az átlaghoz viszonyítva nagyon magas szennyezettségű tételek is előfordultak. A 100 ng/kg feletti értékek rendre: 110, 122, 141, 149, 150, 190, 238, 240, 252, 260, 292, 376, 513, 740 és 860 ng/kg. Az eredmények realitását nem volt módunk ellenőrizni, de nem láttunk okot a kihagyásukra sem, ezért a teljes adatsort felhasználtuk a további számításainkban. További 1177 minta vizsgálatára a Debreceni Egyetem és a NÉBIH „A magyar fogyasztók rövid és hosszútávú aflatoxin terhelésének meghatározása a tejtermékláncban és a kockázatkezelő intézkedések megalapozása” című közös projektjének keretében 2021 januárjáig került sor. Az utóbbi esetben a projektben közreműködő 9 tehenészeti telepről származó tejet a tejipari vállalat munkatársai által közvetlenül a szállító tankerből vett mintákban, 2019-2021 között, a Debreceni Egyetem Műszerközpont laboratóriuma ELISA módszerrel vizsgálta. A 20 ng/kg „cselekvési szintet” meghaladó mintákban a pontos AFM1 koncentrációt a NÉBIH laboratóriumában HPLC vizsgálattal erősítették meg. Az LOQ fölötti minták száma 672 (57,1%). A 20 ng/kg koncentrációt meghaladó minták esetén a tejtermelő gazdaságot értesítették, javasolva a megfelelő megelőző intézkedések megtételét. Ezen beavatkozás eredményeként sikerült a tej szennyezésének emelkedését megállítani és a termelt tej AFM1 szennyezését az 50 ng/kg szint alatt tartani. A részletes eredményekről a projekt zárójelentésében számolunk be.

A vizsgált tejminták számát évenkénti bontásban a 4. ábra mutatja.

4. ábra. A NÉBIH országos felmérésből és a közös projektben résztvevő tejtermelő gazdaságokból származó minták éves vizsgálati száma

A becslésünk finomítására, a nagyarányú LOQ alatti értékek kompenzálására a szokásos LOQ, LOQ=0 és LOQ/2 közelítések helyett a koncentráció adatok LOQ alatti értékeit a mérési eredmények számával megegyező elemű, eloszlás segítségével generált adatok értékével is figyelembe vettük. Az LOQ feletti mérési eredményekre az R statisztikai szoftver maximum likelihood becslést alkalmazó GAMLSS és GAMLSS.dist csomagjainak használatával különböző eloszlásokat illesztettünk, majd az illeszkedés jóságát leíró paraméterek (AIC – Akaike’s Information Criterion, BIC – Bayesian Information Criterion és teljes eltérés – Global Deviance) segítségével kiválasztottuk az optimális illesztést adó eloszlásokat. Az illesztések megfelelőségét az adatokból készített hisztogram és a kapott eloszlás vizuális összevetésével, valamint az eltérések normalitás vizsgálatával és Q-Q plot segítségével is kiértékeltük. A két legjobban illeszkedő eloszlás a két paraméteres lognormális (6. ábra) és a négy paraméterrel jellemezhető Box-Cox t-eloszlás (BCT) (7. ábra) volt, amely alkalmas az aflatoxinokhoz hasonló, pozitív vagy negatív torzulást mutató, lassan lecsengő, folyamatos eloszlással jellemezhető adatok modellezésére [68, 69]. Az expozíció számításokat az LOQ=5 feltételezéssel generált lognormál eloszlással végeztük. A kiválasztott eloszlásokat ezt követően a teljes AFM1 adatsorra illesztettük, a kiértékelést újra elvégeztük. Tekintve, hogy az illesztés jóságát leíró paraméterekben pozitív változást figyeltünk meg, a választott eloszlásokat elfogadhatónak ítéltük.

Az AFM1 vizsgálati eredmények és az illesztett eloszlás leíró statisztikáit a 3. táblázat foglalja össze.

3. táblázat. A számításokhoz felhasznált AFM1 vizsgálati eredmények (ng/kg) leíró statisztikája

A NÉBIH és a DEE vizsgálati eredményeinek relatív gyakorisági eloszlását az 5. ábra mutatja.

5. ábra. A NÉBIH ellenőrzési programjában és a DE-NÉBIH együttműködés keretében vett tejminták AFM1 szennyezésének relatív gyakorisági eloszlása

A 10-15 ng/kg tartományba eső NÉBIH mérési eredmények kiugró értékének (kék keretes piros csillaggal jelölve) kivételével az AFM1 koncentrációk gyakorisága az LOQ-70 ng/kg tartományban a két méréssorozat-ban nagyon hasonló és indokolja a mérési eredmények együttes értékelését. A 70 ng/kg koncentráció feletti AFM1-et tartalmazó minták relatív gyakorisága a NÉBIH vizsgálatainál <0,5%.

Az aflatoxinok kockázatbecslése szempontjából limitáló tényező a szennyező adatok hiánya volt. Az EFSA ajánlása [29] alapján ki kell zárni azokat az élelmiszer kategóriákat, amelyek esetében a pozitív minták száma nem haladja meg a 25-öt, vagy a meghatározási határ alatti minták aránya nagyobb, mint 80%. Az AFM1 eredmények tekintetében csak a tejvizsgálatok feleltek meg ennek a kritériumnak (4. táblázat), a feldolgozott tejtermékek vizsgálatainak száma igen csekélynek bizonyult.

4. táblázat. A vizsgált minták száma és az >LOQ értékek %-os aránya

1: Tápszer: csecsemőtápszer és egyéb kisgyermek élelmiszer
2: Tejalapú élelmiszer

6. ábra. A tejben mért LOQ feletti AFM1 koncentráció eredményekre illesztett lognormális eloszlás
7. ábra. A tejben mért LOQ feletti AFM1 koncentráció eredményekre illesztett Box-Cox t-eloszlás

4. A fogyasztók expozíciója

Az élelmiszerfogyasztási adatok esetében a hosszútávú becsléshez ajánlott OIM (Observed Individual Means, megfigyelt egyéni átlag) módszert alkalmaztuk. Először valamennyi tej és tejtermék fogyasztási adatot átszámítottuk tej ekvivalensre, az adott élelmiszerkategóriára jellemző dúsulási és feldolgozási faktorok segítségével (2. és 3. egyenlet).

Az e1, ..., ej élelmiszerek g/ttkg-ban kifejezett bevitele (B) adott (n) fogyasztási napon, tej ekvivalensben kifejezve:

ahol

me = a fogyasztott e élelmiszer tömege (g) ni fogyasztási napon,

F az e élelmiszerre vonatkozó feldolgozási (például dúsulási) faktor,

ttkg az adott fogyasztási naphoz tartozó személy testtömege,

ahol az e élelmiszer készítéséhez felhasznált tejben a feldolgozott élelmiszerben az AFM1 koncentráció.

Az Fe a kísérletekben kapott min., med., max. eredményekből számított érték.

A g/ttkg/napban kifejezett fogyasztott mennyiségeket megszorozva az illesztett eloszlásfüggvények értékeiből számított átlag AFM1 koncentrációval (ng/kg), megkaptuk az egyes fogyasztási napokra vonatkozó expozíció-értékeket (ng/kg ttkg/nap). A fogyasztásban résztvevő személyek – a 2018-2020-as felmérés esetében 2, a 2009-es felmérés esetében 3 – fogyasztási napjaihoz tartozó beviteli értékeket átlagoltuk. Az eredményeket fogyasztói korcsoportonként összesítettük és mindkét élelmiszerfogyasztási felmérés adataival kiszámoltuk a fogyasztók expozícióját.

Először a feldolgozási faktorok minimum (Fmin), medián (Fmed), maximum (Fmax) értékeinek hatását vizsgáltuk az expozícióbecslés eredményére. A számítást az illesztett lognormális AFM1 átlag adatokkal, valamint 2018-2020-as felmérés átlagos (EDIátl) és 97,5. percentilis (EDI0,975) tejfogyasztási értékeivel végeztük. Az eredményeket az 5. táblázatban foglaltuk össze. A táblázat a determinisztikus módszerrel számított átlag és 97,5. percentilis eredmények közötti különbségeket szemlélteti a 2018-2020-as (EU MENU) felmérés alapján.

5. táblázat. A különböző korcsoportok becsült napi együttes tej és tejtermék fogyasztása a tejtermékek feldolgozási faktorainak a függvényében

A feldolgozási faktorok minimum-medián-maximum értékeinek figyelembevétele nem befolyásolta számottevően az eredményeket. Szignifikáns különbség csak a tipegők korcsoportjának átlag értékeinél, a minimum és medián faktorok esetében adódott, ezért a továbbiakban a különböző expozícióbecslési eredmények bemutatásához a feldolgozási és feldúsulási faktorok mediánjával számolt értékeket használjuk.

A különböző korcsoportok expozícióját a 2009-es élelmiszerfogyasztási felmérés P0,05, átlag, medián és P0,975 percentilis becsült napi beviteli értékek (EDI), a medián feldolgozási faktorok és az AFM1 koncentráció adatok átlaga alapján számítottuk. A különböző fogyasztói korcsoportok expozícióját a számított EDI alapján hasonlítottuk össze (8. ábra).

8. ábra. Becsült napi beviteli értékek (ng/ttkg/nap), determinisztikus becslés; Különböző korcsoportok P0,025, átlag, medián és P0,95 EDI értékeinek összehasonlítása a 2009-es fogyasztási adatok alapján

A 2018-2020-as felmérés korcsoportjainak becsült napi beviteli értékei a 2009-es adatokhoz hasonló tendenciát mutatnak (9. ábra).

9. ábra. Becsült napi beviteli értékek (ng/ttkg/nap), determinisztikus becslés; A különböző korcsoportok P0,025, átlag, medián és P0,95 EDI értékeinek összehasonlítása a 2009 és 2018-2020-as fogyasztási adatok alapján

Mind az átlag, mind a 97,5. percentilis becsült napi beviteli értékeket összehasonlítva azt láthatjuk, hogy az egyes korcsoportok expozíciója az elmúlt 10 évben többnyire állandónak bizonyult. Szembetűnő különbség csak a tipegők korcsoportjának átlagértékei és a gyermekek korcsoportjának 97,5. percentilis értékei között figyelhető meg, de a különbégek nem szignifikánsak. A 2009-es felmérés tipegők korcsoportjának elemszáma nagyon alacsony (90 fő) a 2018-2020-as felméréshez (482 fő) viszonyítva. A kisebb elemszámmal számított értékek nagyobb bizonytalansággal terheltek.

4.1. A fogyasztói expozíció értékelése

A kapott expozíció értékek alapján a magyar lakosság kockázatának értékelésére az expozíciós tűréshatár (Margin of Exposure, MoE) megközelítést (3. egyenlet), a veszélyességi indexet (hazard index, HI) (4. egyenlet), valamint a AFM1 bevitelnek tulajdonítható májrák-előfordulás valószínűségének növekedését alkalmaztuk. A MoE módszerhez az AFM1-re vonatkozó BMDL10=4 μg/ttkg/nap értéket vettük figyelembe:

A fogyasztók expozíciója akkor tekinthető kockázatosnak, ha a MoE értéke <10.000. A 2018-2020 élelmiszerfogyasztási felmérés fogyasztási adataiból determinisztikus becsléssel számított kitettségi értékek MoE értékeit a 6. táblázat mutatja.

6. táblázat. Az átlagos és nagy fogyasztók (97,5. percentilis) MoE értékei korcsoportonként

Az egészségügyi kockázatot kifejező határ (10 000) alatt csak a tipegők, és gyermekek „nagy fogyasztói” (97,5 percentilis) korcsoportjai érik el, illetve közelítik. A többi korcsoport esetében ezzel a kockázatjellemzési metodikával nem állapítható meg jelentős kockázat.

A veszélyességi index számítására a Kuiper-Goodmann által javasolt [59] biztonságos dózist alkalmaztuk (0,2 ng/ttkg):

A veszélyességi index (HI) számítása esetében a kockázat mértéke az EDI értékekkel egyenesen arányos és 1 vagy annál nagyobb értékek esetén minősül aggályosnak. Példaként a 2018-2020-as élelmiszerfogyasztási felmérés fogyasztási adataival végzett determinisztikus becslések eredményeit korcsoportonként a 7. táblázat tartalmazza.

7. táblázat. A különböző korcsoportok EDI értékeiből számított veszélyességi indexek (HI)

Megjegyzés: Az egészségügyi kockázatot jelentő HI értékeket félkövér számok jelzik

A korcsoportok becsült napi beviteli értékeinek átlagából és 97,5. percentilis értékeiből számított HI értékek azt mutatják, hogy a serdülők, a felnőttek és az idősek korcsoportjának kitettségéből adódó kockázat nem minősül aggályosnak. Azonban a tipegők és gyermekek esetében a 97,5. percentilis értékek (nagy fogyasztók) esetében az expozíció jelentősen meghaladja a biztonságosnak tekinthető szintet. A fenti eredmények közül az egyik legfontosabb a tipegők átlagos bevitelét jellemző 1-es HI érték, mivel ez arra enged következtetni, hogy ennek a korosztálynak a jelentős hányada egészségügyi szempontból aggályos mértékű AFM1 expozíciónak van kitéve.

A májrák aflatoxin expozícióval összefüggő incidenciáját, 0,7%-os magyar hepatitis B prevalenciát [70] feltételezve az 1-es egyenlettel számítottuk. A számításokat a májrák-kialakulás valószínűségének az átlagos és a felső 95%-os konfidencia értékével is elvégeztük:

Átlag RMo= [(0,0269 × 0,007) + (0,0017× 0,993)] × EDI,

CI,.95 RMo= [(0,0562 × 0,007) + (0,0049× 0,993)] × EDI.

A 2018-2020 élelmiszerfogyasztási felmérés fogyasztási adataiból determinisztikus (DET) becsléssel számított AFM1 expozíció értékek átlag és 97,5. percentilis eredményeiből származtatott, aflatoxin kitettségnek tulajdonítható májrák incidencia (HCCi) értékeket (megbetegedés/100 000 fő/év) korcsoportonként a 8. táblázatban foglaltuk össze.

8. táblázat. Májrák incidencia EDI függvényében korcsoportonként

A HCC kialakulásának kockázatát az aflatoxin-kitettség a krónikus hepatitis B előfordulása mellett a sokszorosára növeli. Mivel a hepatitis B prevalenciája Magyarországon (és általánosságban Európában) alacsony, az aflatoxin indukált HCCi növekedése sem mutat magas értékeket. Ugyan a becsült májrák incidenciák számszerű értéke nagyon alacsonynak bizonyult, a 8. táblázat egymáshoz viszonyított értékei ebben az esetben is megmutatják a tipegők és a gyermekek „nagy fogyasztóinak” kiemelt kockázatát a többi korcsoporthoz viszonyítva.

5. Helyzetértékelés, javaslatok

A determinisztikus módszerrel számított AFM1 krónikus expozíció különböző referenciaértékekhez viszonyítva egybehangzóan azt jelzi, hogy a vizsgált korcsoportokban az 1-3 éves gyermekek kitettsége a legmagasabb. Legalacsonyabb kitettségi értékek a legidősebb korcsoportok esetében figyelhetők meg. Adathiány miatt nem lehetett a <1 éves csecsemők expozícióját vizsgálni. Az összefüggés azonban nem közvetlenül a kor és a beviteli mennyiségek, hanem az idősödő korcsoportok (jellemzően növekvő) testtömegében megfigyelhető változás és a bevitt mennyiségek között van.

Tekintve, hogy az aflatoxinok toxicitása elsődlegesen a fejlődő szervezeteknél jelent egészségügyi kockázatot, különös figyelmet kell fordítani az expozíciójuk csökkentésére, lehető legalacsonyabb szinten tartására. Hangsúlyozzuk azonban, hogy a rákkeltő vegyületek jelenlétét minden korcsoportban a lehető legalacsonyabb szinten kell tartani.

A szervezetet nem csak az anyatej és egyéb tej vagy tej alapú készítmény AFM1 szennyezése terheli, hanem az egyéb élelmiszerekkel bevitt, az AFM1-nél közel 10-szer toxikusabb AFB1 is. Mivel a hatásmechanizmusuk azonos, az aflatoxinok és az AFM1 hatása összeadódik. Ezért figyelni kell az élelmiszereink minőségére, a felbontott csomagolású termékek tárolási körülményeire. A dohos szagú, penésznyomokat mutató termékeket fogyasztani még főzés, sütés után sem szabad.

Az éves monitoring vizsgálatok során mért, a jogszabályban eltűrhető maximális szintet 10-15-ször meghaladó szennyezettségű tejek is forgalomba kerülnek. Különösen veszélyeztetett csoportba tartoznak azok a személyek, akik rendszeresen olyan, azonos forrásból származó tejet fogyasztanak, ahol az állatokat aflatoxinnal szennyezett takarmánnyal etetik.

A mai napig nincs olyan rutinszerűen és ipari szinten, nagy tételben alkalmazott eljárás, amellyel megbízhatóan és tökéletesen lehet eliminálni az élelmiszerek aflatoxin tartalmát, ezért a hangsúly továbbra is a szennyeződés megelőzésén van. Ez egy komplex, az élelmiszerlánc valamennyi szereplőjének közreműködését igénylő feladat, amely a jó mezőgazdasági gyakorlatok alkalmazásával, a termőföldek megfelelő előkészítésével és kezelésével kezdődik. Ezt követi a penészgombáknak ellenálló hibridek kiválasztása, a termények aratása, szállítása és tárolása során tett intézkedések sora, amelyek megakadályozhatják a penészgombák elszaporodását (megfelelő hőmérsékleti és nedvességi szintek beállítása, a termények átválogatása, hántolása, fizikai kezelése). Nem utolsó sorban a takarmányozásra szánt gabonák, szilázs vagy más feldolgozott takarmány-készítmények megfelelő tárolása, kezelése és aflatoxin tartalmának ellenőrzése, szükség szerint fizikai, kémiai vagy biológiai detoxifikálása [4].

A prevenció sikeressége, a tejszállítmányok megfelelősége a tejtermelő tehenészeti telepek és a tejtermelő üzemek szintjén is ellenőrizhető. A nyers tej aflatoxin M1 tartalmának detektálására kidolgozott mintavételi terv és korai előrejelzési rendszer segítségével, az Olaszországban már a gyakorlatban bevált 20 ng/kg cselekvési küszöb alkalmazásával hatékonyan előre lehet jelezni a szennyeződés mértékének emelkedését. A tejtermelő gazdaság a jelzés alapján a helyi körülményeknek megfelelő módon, például a takarmányösszetétel módosításával, toxinkötők alkalmazásával megelőzheti a jogszabályban meghatározott, eltűrhető maximális (50 ng/kg) AFM1 koncentráció elérését. Ezáltal csökkenthető a szennyezett tejtételek felhasználása az elsődleges és másodlagos tejfeldolgozásban és ez következésképpen csökkentené a fogyasztók expozícióját [1, 10, 71].

Fel kell hívni a figyelmet arra is, hogy az 50 ng/kg AFM1 koncentráció jelzésére beállított ELISA kitek a detektálás bizonytalanságából adódóan a ≤65-70 ng/kg szennyezettségű tej tételt még az esetek 50%-ban megfelelőnek minősíthetik.

Az AFM1 expozíciónak leginkább kitett és egyúttal a legérzékenyebb csecsemők és kisgyerekek, de a teljes lakosság egészségvédelme érdekében javasoljuk a tejüzemek ellenőrzésének rendeleti módosítását úgy, hogy a beszállított tej ≥20 ng/kg AFM1 szennyezettsége esetén a tejüzem köteles értesíteni a tejtermelő gazdaságot valamint a NÉBIH-et, és a továbbiakban a gazdaságból beszállított tej szennyezettségének napi ellenőrzésével figyelemmel kísérni a szennyezés csökkentésére tett tejgazdasági intézkedés hatékonyságát.

Javasoljuk továbbá a tejgazdaságok önellenőrzésénél a jelzési küszöböt a 20 ng/kg-os értékre beállítani a jelenlegi 50 ng/kg helyett. Mind a tejüzemi, mind a termelői ellenőrzéshez rendelkezésre állnak az AFM1-t 5-10 ng/kg koncentrációban detektáló ELISA kitek, tehát az új jelzési küszöb előírásának metodikai akadálya nincs.

6. Köszönetnyilvánítás

A szerzők köszönetüket fejezik ki Sali Juditnak és Csizmadia Katalinnak a NÉBIH 2018-2020-as fogyasztási felmérése vonatkozó adatainak az átadásáért, a DE Műszerközpont, valamint a NÉBIH munkatársainak a tejminták AFM1 analitikai vizsgálatainak elvégzéséért, Nagy Attilának és Miklós Gabriellának, a NÉBIH munkatársainak hasznos megjegyzéseikért, a DE-NÉBIH projektben közreműködő Béri Bélának, valamint az Alföldi Tej és a tejtermelő gazdaságok vezetőinek és munkatársainak az együttműködésért.

Kutatási programunkat 2018-1.2.1-NKP-2018-00002 (AA, KK) jelzéssel a Nemzeti Kutatási, Fejlesztési és Innovációs alap támogatta a 2018-1.2.1-NKP alapítványi rendszerben.

7. Irodalom

[1] Ambrus Á., Szenczi-Cseh, J., Griff, T., Kerekes K., Miklós G., Szigeti, T., Vásárhelyi, A. (2020): Élelmiszereink mikotoxin és növényvédőszer-maradék szennyezettségének élelmiszerbiztonsági megítélése 2. rész Mikotoxinok; Food safety assessment of the mycotoxin and pesticide residue contamination of our foods, Part 2. Mycotoxins. Journal of food Investigation, LXVI (2) pp. 2923-2949. 

[2] Pfliegler, W. P., Pócsi, I., Győri, Z., & Pusztahelyi, T. (2020): The Aspergilli and Their Mycotoxins: Metabolic Interactions With Plants and the Soil Biota. Frontiers in Microbiology, Vol. 10 2908. doi:https://doi.org/10.3389/fmicb.2019.02921

[3] Ráduly, Z., Szabó, L., Madar, A., Pócsi, I., & Csernoch, L. (2020): Toxicological and Medical Aspects of Aspergillus-Derived Mycotoxins Entering the Feed and Food Chain. Frontiers in Microbiology 10. doi: https://doi.org/10.3389/fmicb.2019.02908

[4] Peles, F., Sipos, P., Kovács, S., Győri, Z., Pócsi, I., Pusztahelyi, T. (2021): Biological Control and Mitigation of Aflatoxin Contamination in Commodities. Toxins 13 (104). https://doi.org/10.3390/toxins13020104

[5] Mahato, D.K., Lee, K.E., Kamle, M., Devi, S., Dewangan, K.N., Kumar, P, Kang, S.G. (2019): Aflatoxins in Food and Feed: An Overview on Prevalence, Detection and Control Strategies. Front. Microbiol. Vol. 10 (2266) doi: https://doi.org/10.3389/fmicb.2019.02266

[6] Filazi, A., Tansel, U. (2019): Occurrence of Aflatoxins in Food (2013): in Mehdi Razzaghi, Abyaneh (Szerk.), Aflatoxins - Recent Advances and Future Prospects. doi: https://doi.org/10.5772/51031

[7] Mikló, G., Angeli, C., Ambrus, Á., Nagy, A., Kardos, V., Zentai, A., Kerekes, K., Farkas, Z., Józwiak, Á., Bartók, T. (2020): Detection of Aflatoxins in Different matrices and Food-Chain Positions. Front. Microbiol 11 (1916) doi: https://doi.org/10.3389/fmicb.2020.01916

[8] Pócsi, I., Giacometti, F., Ambrus, Á. and Logrieco, A.F. (2020): Editorial: Aspergillus-Derived Mycotoxins in the Feed and Food Chain. Front. Microbiol 11 (606108). doi: https://doi.org/10.3389/fmicb.2020.606108

[9] Martinez-Miranda, M. M., Rosero-Moreano, M., and Taborda-Ocampo, G. (2019): Occurrence, dietary exposure and risk assessment of aflatoxins in arepa, bread and rice. Food Control 98 pp. 359–366. doi: https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2018.11.046

[10] Serraino, A., Bonilauri, P., Kerekes, K., Farkas, Z., Giacometti, F., Canever, A., Zambrini, A.V., Ambrus, Á. (2019): Occurrence of Aflatoxin M1 in raw milk marketed in Italy: Exposure Assessment and Risk Characterization. Front. Microbiol. 10 (2516) doi: https://doi.org/10.3389/fmicb.2019.02516

[11] Udovicki, B., Ilija Djekic, I., Eleni P., Kalogianni, E.P., Rajkovic, A. (2019): Exposure assessment and risk characterization of aflatoxin m1 intake through consumption of milk and yoghurt by student population in Serbia and Greece. Toxins 11 (4) pp. 205-216. https://doi.org/10.3390/toxins11040205

[12] Peles, F., Sipos, P., Győri, Z., Pfliegler, W.P., Giacometti, F., Serraino, A., Pagliuca, G., Gazzotti, T., Pócsi, I. (2019): Adverse Effects, Transformation and Channeling of Aflatoxins Into Food Raw Materials in Livestock. Front. Microbiol. 10 (2861) doi: https://doi.org/10.3389/fmicb.2019.02861

[13] Campagnollo, F. B., Ganev, K. C., Khaneghah, A. M., Portela, J. B., Cruz, A. G., Granato, D., Corassin, C. H., Oliveira, C. A. F., Sant’Ana, A. S. (2016): The occurrence and effect of unit operations for dairy products processing on the fate of aflatoxin M1: A review. Food Control 68 pp. 310-329. doi: https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2016.04.007

[14] Wolzak, A., Pearson, A. M., Coleman, T. H. (1986): Aflatoxin carry-over and clearance from tissues of laying hens. Food and Chemical Toxicology 24 pp. 37-41. doi: https://doi.org/10.1016/0278-6915(86)90262-0

[15] Hussain, Z., Khan, M. Z., Khan, A., Javed, I., Saleemi, M. K., Mahmood, S., Asi, M. R. (2010): Residues of aflatoxin B1 in broiler meat: Effect of age and dietary aflatoxin B1 levels. Food and Chemical Toxicology 48 pp. 3304-3307. doi: https://doi.org/10.1016/j.fct.2010.08.016

[16] Bintvihok, A., Thiengnin, S., Doi, K., & Kumagai, S. (2002): Residues of Aflatoxins in the Liver, Muscle and Eggs of Domestic Fowls. Journal of Veterinary Medical Science 64 (11) pp. 1037–1039. doi: https://doi.org/10.1292/jvms.64.1037

[17] Moran, C. A., Kettunen, H., Yiannikouris, A., Ojanperä, S., Pennala, E., Helander, I. M., & Apajalahti, J. (2013): A dairy cow model to assess aflatoxin transmission from feed into milk – Evaluating efficacy of the mycotoxin binder Mycosorb®. Journal of Applied Animal Nutrition, 2. doi: https://doi.org/10.1017/jan.2013.12

[18] Britzi, M., Friedman, S., Miron, J., Solomon, R., Cuneah, O., Shimshoni, J., Shlosberg, A. (2013): Carry-Over of Aflatoxin B1 to Aflatoxin M1 in High Yielding Israeli Cows in Mid- and Late-Lactation. Toxins 5(1), pp. 173–183. doi: https://doi.org/10.3390/toxins5010173

[19] Battacone, G., Nudda, A., Palomba, M., Pascale, M., Nicolussi, P., Pulina,G. (2005): Transfer of Aflatoxin B1 from Feed to Milk and from Milk to Curd and Whey in Dairy Sheep Fed Artificially Contaminated Concentrates. J. Dairy Sci. 88 (9) pp. 3063–3069. doi: https://doi.org/10.3168/jds.S0022-0302(05)72987-8

[20] JECFA (2018): Aflatoxins. In: Safety evaluation of certain contaminants in food: prepared by the eighty-third meeting of the Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives (JECFA). FAO JECFA Monographs, pp. 3-280. SBN (PDF) 978-92-4-069847-5

[21] Fakhri, Y., Ghorbani, R., Taghavi, M., Keramati, H., Amanidaz, N., Moradi, B., Nazari, S.H., Shariatifar, N., Khaneghah, A.M. (2019): Concentration and Prevalence of Aflatoxin M1 in Human Breast Milk in Iran: Systematic Review, Meta-Analysis, and Carcinogenic Risk Assessment: A Review. Journal of Food Protection 82 (5) pp. 785–795. doi: https://doi.org/10.4315/0362-028X.JFP-18-367

[22] Fakhri, Y., Rahmani, J., Oliveira, C.A.F., Franco, L.T., Corassin, C.H., Saba, S., Rafique, J., Khaneghah, A.M. (2019): Aflatoxin M1 in human breast milk: a global systematic review, metaanalysis, and risk assessment study (Monte Carlo simulation). Trends in Food Science & Technology 88 (5) pp. 333-342. doi: https://doi.org/10.1016/j.tifs.2019.03.013

[23] Radonić, J. R., Kocić Tanackov, S. D., Mihajlović, I. J., Grujić, Z. S., Vojinović Miloradov, M. B., Škrinjar, M. M., & Turk Sekulić, M. M. (2017): Occurrence of aflatoxin M1 in human milk samples in Vojvodina, Serbia: Estimation of average daily intake by babies. Journal of Environmental Science and Health, Part B 52 (1) pp. 59-63. doi: https://doi.org/10.1080/03601234.2016.1229454

[24] Kunter, I., Hürer, N., Gülcan, H. O., Öztürk, B., Dogan, I., Sahin, G. (2017): Assessment of Aflatoxin M1 and Heavy Metal Levels in Mothers Breast Milk in Famagusta, Cyprus. Biol Trace Elem Res. 175 pp. 42-49. doi: https://doi.org/10.1007/s12011-016-0750-z

[25] Valitutti, F., De Santis, B., Trovato, C.M., Montuori, M., Gatti, S., Oliva, S., Brera, C., Catassi, C. (2018): Assessment of Mycotoxin Exposure in Breastfeeding Mothers with Celiac Disease. Nutrients 10 (3) doi: https://doi.org/10.3390/nu10030336.

[26] Bogalho, F., Duarte, S., Cardoso, M., Almeida, A., Cabeças, R., Lino, C., Pena, A. (2018): Exposure assessment of Portuguese infants to Aflatoxin M1 in breast milk and maternal social-demographical and food consumption determinants, Food Control doi: https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2018.02.043

[27] Csapó, J., Albert, C., Sipos, P. (2020): The aflatoxin content of milk and dairy products as well as breast milk and the possibilities of detoxification. Acta Universitatis Sapientiae, Alimentaria, 13 pp. 99-117. doi: https://doi.org/10.2478/ausal-2020-0006

[28] Trevisani, M., Farkas, Z., Serraino, A., Zambrini, A. V., Pizzamiglio, V., Giacometti, F. Ambrus, A. (2014): Analysis of industry-generated data. Part 1: a baseline for the development of a tool to assist the milk industry in designing sampling plans for controlling aflatoxin M1 in milk. Food Additives & Contaminants: Part A: Chemistry, Analysis, Control, Exposure & Risk Assessment 31 (7) pp. 1246-1256. doi: https://doi.org/10.1080/19440049.2014.925587

[29] EFSA Panel on Contaminants in the Food Chain (2020): Scientific opinion - Risk assessment of aflatoxins in food. EFSA Journal 18 (e06040) pp. 1-112. doi: https://doi.org/10.2903/j.efsa.2020.6040

[30] IARC (2012): Aflatoxins. Chemical Agents and Related Occupations. A review of Human Carcinogens. IARC monographs on the evaluation of carcinogenic risks to humans.

[31] Pascal, A., Risco-Castillo, V., Jouvion, G., Le Barzic, C. and Guillot, J. (2021): Aspergillosis in Wild Birds. J. Fungi 7 (3) p. 241; doi: https://doi.org/10.3390/jof7030241

[32] JECFA, (2001): Aflatoxin M1. In: Safety evaluation of certain mycotoxins in food. FAO Food and Nutrition Paper 74 pp. 1-102.

[33] WHO (2002): Evaluation of certain mycotoxins in food TRS 906-JECFA 56/8 WHO technical report series 906 https://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/42448/WHO_TRS_906.pdf?sequence=1 (Hozzáférés: 2021.01.28.)

[34] Bedard, L. L., Massey, T. E. (2006): Aflatoxin B1-induced DNA damage and its repair. Cancer Letters, 241 (2) pp. 174-83. doi: https://doi.org/10.1016/j.canlet.2005.11.018

[35] EFSA (2007): Opinion of the scientific panel on contaminants in the food chain (CONTAM) related to the potential increase of consumer health risk by a possible increase of the existing maximum levels for aflatoxins in almonds, hazelnuts and pistachios and derived products. EFSA Journal 5 446. doi: https://doi.org/10.2903/j.efsa.2007.446

[36] Williams, J. H., Phillips, T. D., Jolly, P. E., Stiles, J. K., Jolly, C. M. & Aggarwal, D. (2004): Human aflatoxicosis in developing countries: a review of toxicology, exposure, potential health consequences, and interventions. The American Journal of Clinical Nutrition 80 pp. 1106-1122. doi: https://doi.org/10.1093/ajcn/80.5.1106

[37] Wang, J. S. & Groopman, J. D. (1999): DNA damage by mycotoxins. Mutation Research 424 (1-2) pp. 167-181. doi: https://doi.org/10.1016/s0027-5107(99)00017-2

[38] Denning, D. W., Allen, R., Wilkinson, A. P. & Morgan, M. R. (1990): Transplacental transfer of aflatoxin in humans. Carcinogenesis 11 (6) pp. 1033-1035. doi: https://doi.org/10.1093/carcin/11.6.1033

[39] Serrano-Niño, J. C., Cavazos-Garduño, A., Hernandez-Mendoza, A., Applegate, B., Ferruzzi, M. G., San Martin-González, M. F., García, H. S. (2013): Assessment of probiotic strains ability to reduce the bioaccessibility of aflatoxin M1 in artificially contaminated milk using an in vitro digestive model. Food Control 31 (1) pp. 202-207. doi: https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2012.09.023

[40] Bullerman, L. B., Bianchini, A. (2014): Good Food-Processing Techniques: Stability of Mycotoxins in Processed Maize-Based Foods. In: LESLIE, J. F. (Szerk.) Mycotoxin Reduction in Grain Chains. Ames, Iowa, USA: Wiley Blackwell, John Wiley & Sons, Inc. p. 92-97 ISBN 978-0-8138-2083-5

[41] Ali, N. (2019): Aflatoxins in rice: worldwide occurrence and public health perspectives. Toxicology Reports. doi: https://doi.org/10.1016/j.toxrep.2019.11.007

[42] Prandini, A., Tansini, G., Sigolo, S., Filippi, L., Laporta, M., Piva, G. (2009): On the occurrence of aflatoxin M1 in milk and dairy products. Food and Chemical Toxicology, 47 (5) pp. 984-991. doi: https://doi.org/10.1016/j.fct.2007.10.005.

[43] Yosef, T. A., Al-Julaifi, M. Z., Salah-El-Dein, W. M., Al-Rizqi, A. M. (2013): Assessment of Aflatoxin M1 Residues in Raw Cow Milk at Al- Riyadh Area with Reference to Some Detoxification Applications. Life Science Journal - Acta Zhengzhou University Overseas Edition, 10 pp. 3365-3369.

[44] Iqbal, S. Z., Jinap, S., Pirouz, A. A. & Faizal, A. R. A. (2015): Aflatoxin M-1 in milk and dairy products, occurrence and recent challenges: A review. Trends in Food Science and Technology, 46 pp. 110-119. doi: https://doi.org/10.1016/j.tifs.2015.08.005

[45] Kuharic, Z., Jakopovic, Z., Canak, I., Frece, J., Bosnir, J., Pavlek, Z., Ivesic, M., Markov, K. (2018): Removing aflatoxin M1 from milk with native lactic acid bacteria, centrifugation, and filtration. Archives of Industrial Hygiene and Toxicology 69 (4) pp. 334-339. doi: https://doi.org/10.2478/aiht-2018-69-3160

[46] Foroughi, M., Jamab, M. S., Keramat, J. & Foroughi, M. (2018): Immobilization of Saccharomyces cerevisiae on Perlite Beads for the Decontamination of Aflatoxin M1 in Milk. Journal of Food Science 83 (7) pp. 2008-2013. doi: https://doi.org/10.1111/1750-3841.14100

[47] Mohammadi, H., Mazloomi, S. M., Eskandari, M. H., Aminlari, M., Niakousari, M. (2017): The Effect of Ozone on Aflatoxin M1, Oxidative Stability, Carotenoid Content and the Microbial Count of Milk. Ozone: Science & Engineering 39(6) pp. 447-453. doi: https://doi.org/10.1080/01919512.2017.1329647

[48] Assaf, J. C., El Khoury, A., Atoui, A., Louka, N., Chokr, A. (2018): A novel technique for aflatoxin M1 detoxification using chitin or treated shrimp shells: in vitro effect of physical and kinetic parameters on the binding stability. Applied Microbiology & Biotechnology 102 pp. 6687-6697. doi: https://doi.org/10.1007/s00253-018-9124-0

[49] Womack, E. D., Sparks, D. L., Brown, A. E. (2016): Aflatoxin M-1 in milk and milk products: a short review. World Mycotoxin Journal 9 (2) pp. 305-315. doi: https://doi.org/10.3920/WMJ2014.1867

[50] Corassin, C. H., Bovo, F., Rosim, R. E., Oliveira, C. A. F. (2013): Efficiency of Saccharomyces cerevisiae and lactic acid bacteria strains to bind aflatoxin M-1 in UHT skim milk. Food Control, 31 (1) pp. 80-83. doi: https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2012.09.033

[51] Kamyar, S., Movassaghghazani, M. (2017): Reduction of Aflatoxin M1 in Milk Using Kefir Starter. Iranian Journal of Toxicology 11 (6) pp. 27-31. doi: https://doi.org/10.29252/arakmu.11.6.27

[52] Rad, M. N., Razavilar, V., Anvar, S. A. A., Akbari-Adergani, B. (2018): Selected bio-physical factors affecting the efficiency of Bifidobacterium animalis lactis and Lactobacillus delbrueckii bulgaricus to degrade aflatoxin M-1 in artificially contaminated milk. Journal of Food Safety, 38 (4) (e12463) doi: https://doi.org/10.1111/jfs.12463

[53] Elsanhoty, R. M., Salam, S. A., Ramadan, M. F., Badr, F. H. (2014): Detoxification of aflatoxin M1 in yoghurt using probiotics and lactic acid bacteria. Food Control 43 pp. 129-134. doi: https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2014.03.002

[54] Hamilton, D., Murray, B., Ambrus, Á., Baptista, G., Ohlin, B., Kovacicova, J. (1997): Optimum use of available residue data in the estimation of dietary intake of pesticides. Pure & Applied Chemistry 69 (6) pp. 1373-1410. doi: https://doi.org/10.1351/pac199769061373

[55] Zentai, A., Szeitzné Szabó, M., Mihucz, G., Szeli, N., Szabó, A., Kovács, M. (2019): Occurrence and risk assessment of fumonisin B1 and B2 mycotoxins in maize-based food products in Hungary. Toxins 11 (12) p. 709. doi: https://doi.org/10.3390/toxins11120709

[56] Zentai, A., Sali, J. , Szabó, I.J., Szeitzné-Szabó, M., Ambrus, Á., Vásárhelyi, A. (2013): Factors affecting the estimated probabilistic acute exposure to captan from apple consumption. Food Additives & Contaminants: Part A 30 (5) pp. 833-842. doi: https://doi.org/10.1080/19440049.2013.794977

[57] Zentai, A., Kerekes, K, Szabó, I., Ambrus, Á. (2015): A fogyasztók növényvédőszermaradékokból származó expozíciójának finomítása, 1. rész. Élelmiszervizsgálati Közlemények LXI (3) pp. 681-719.

[58] EFSA (2010): Management of left-censored data in dietary exposure assessment of chemical substances. EFSA Journal 8 (3) p. 1557 doi: https://doi.org/10.2903/j.efsa.2010.1557

[59] Szenczi-Cseh, J. & Ambrus, A. (2017): Uncertainty of exposure assessment of consumers to pesticide residues derived from food consumed. Journal of Environmental Science and Health B, 52 (9) pp. 658-670. doi: https://doi.org/10.1080/03601234.2017.1331671

[60] EFSA (2006): Opinion of the Scientific Committee related to Uncertainties in Dietary Exposure Assessment. EFSA Journal 438 pp. 1-54. doi: https://doi.org/10.2903/j.efsa.2007.438

[61] Delmaar, C., Heinemeyer, G., Jantunen, M., Schneide, K., Schümann, M. (2020): General Aspects of Exposure Evaluation. In: Heinemeyer, G. (Szerk.) The Practice of Consumer Exposure Assessment. Gewerbestrasse 11, 6330 Cham, Switzerland: Springer Nature Switzerland AG., pp. 55-155. ISBN 978-3-319-96148-4

[62] Gürtler, R. (2020): Hazard Assessment and Derivation of Health-Based Guidance Values. In: Heinemeyer, G. (Szerk.) The Practice of Consumer Exposure Assessment. Gewerbestrasse 11, 6330 Cham, Switzerland: Springer Nature Switzerland AG. pp. 253-254. ISBN 978-3-319-96148-4

[63] Sieke, C. (2020): Principles of Consumer Exposure Assessment for Pesticide Residues. In: Heinemeyer, G. (Szerk.) The Practice of Consumer Exposure Assessment. Gewerbestrasse 11, 6330 Cham, Switzerland: Springer Nature Switzerland AG. pp. 315-322. ISBN 978-3-319-96148-4

[64] Kuiper-Goodman, T. (1990): Uncertainties in the risk assessment of three mycotoxins: aflatoxin, ochratoxin, and zearalenone. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology 68 pp. 1017-1024. doi: https://doi.org/10.1139/y90-155

[65] Szeitzne Szabo, M., Bíró, L., Bíró, Gy., Sali, J. (2011): Dietary survey in Hungary, 2009. Part I. Macronutrients, alcohol, caffeine, fibre. Acta Alimentaria 40 (1) pp. 142-152. doi: https://doi.org/10.1556/AAlim.40.2011.1.16

[66] Csizmadia, K., Larnsak, L., Pfaff, N., Sali, J., (2020): Hungarian national food consumption survey on adults. EFSA supporting publication 17 (12)EN‐1981. p. 26.

[67] Csizmadia, K., Larnsak, L., Pfaff, N., Sali, J. (2020): Hungarian national food consumption survey on toddlers and other children. EFSA supporting publication 17 (12)EN‐1982. p. 26. doi: https://doi.org/10.2903/sp.efsa.2020.EN‐1982

[68] Ferrari, S.L.P., Fumes, G. (2017): Box–Cox symmetric distributions and applications to nutritional data. AStA Adv. Stat. Anal. 101 pp. 321–344. doi: https://doi.org/10.1007/s10182-017-0291-6

[69] Rigby, R.A., Gillian, M. D. S., Heller, Z., De Bastiani, F. (2019): Continous three parameter distribution on (0,∞). Distributions for Modelling Location, Scale and Shape: Using GAMLSS in R. 1 ed.: Chapman and Hall/CRC. ISBN 9780367278847

[70] Horváth, G., Gerlei, Zs., Gervain, J., Lengyel, G., Makara, M., Pár, A., Rókusz, L., Szalay, F., Tornai, I., Werling, K., Hunyady, B. (2018): Diagnosis and treatment of chronic hepatitis B and D. National consensus guideline in Hungary from 22 September 2017. Orvosi Hetilap 159 (1) pp. 24-37. doi: https://doi.org/10.1556/650.2018.31004

[71] Kerekes, K., Bonilauri, P., Serraino, A., Giacometti, F., Piva, S., Zambrini, V., Canever, A., Farkas, Z., Ambrus, A. (2016): An effective self-control strategy for the reduction of aflatoxin M1 content in milk and to decrease the exposure of consumers. Food Additives and Contaminants Part A Chemistry, Analysis, Control, Exposure & Risk Assessment 33 (12) pp. 1840-1849. doi: https://doi.org/10.1080/19440049.2016.1241895

Tovább a cikk olvasásához


A laktációszám és a laktáció stádium hatása a tejmennyiségre, a nyers tehéntej összetételére és mikrobiológiai tulajdonságaira egy hazai tehenészeti telepen

Cikk letöltése PDF formátumban

A laktációszám és a laktáció stádium hatása a tejmennyiségre, a nyers tehéntej összetételére és mikrobiológiai tulajdonságaira egy hazai tehenészeti telepen

DOI: https://doi.org/10.52091/EVIK-2021/2-3-HUN

Érkezett: 2020. július – Elfogadva: 2020. november

Szerzők

1 Debreceni Egyetem, Mezőgazdaság-, Élelmiszertudományi és Környezetgazdálkodási Kar, Élelmiszertudományi Intézet
2 Debreceni Egyetem, Mezőgazdaság-, Élelmiszertudományi és Környezetgazdálkodási Kar, Állattudományi, Biotechnológiai és Természetvédelmi Intézet, Állattenyésztési nem önálló Tanszék
3 Debreceni Egyetem, Állattenyésztési Tudományok Doktori Iskola

Kulcsszavak

laktációszám, laktáció stádium, tehéntej, tejmennyiség, tejösszetétel, mikrobiológia

1. Összefoglalás

A tej összetételének és higiéniai tulajdonságainak változásai befolyásolják a termelői árat, ezért elengedhetetlen, hogy a felelős tejtermelő információt gyűjtsön ezen paraméterek különböző tényezők hatására bekövetkező változásairól. A szerzők a tanulmányukban arra keresik a választ, hogy tapasztalható-e változás a tehenek napi tejmennyiségében, illetve a nyers tehéntej összetételében (zsír- és fehérjetartalom) és mikrobiológiai tulajdonságaiban (szomatikus sejtszám, összcsíraszám, coliform- és S. aureus-szám) az egyszer és többször ellett teheneknél, illetve a laktációjuk különböző stádiumaiban. Egy hazai nagyüzemi tejtermelő telep adatai alapján megállapították, hogy a tej zsír- és fehérjetartalmában ugyan nem volt különbség, de a többször ellett teheneknél nagyobb volt a napi tejhozam, valamint az egyszer ellett tehenek tejéhez képest a tejben magasabb volt a szomatikus sejtszám és nagyobb mennyiségben fordultak elő coliform baktériumok. A napi tejmennyiség a laktáció egymást követő stádiumaiban csökkent, viszont a tej zsír- és fehérjetartalma növekedést mutatott, amely feltételezhetően a csökkenő tejmennyiség koncentráló hatásának tulajdonítható. A mikroorganizmusok telepszámában a laktáció különböző stádiumaiban nem tapasztaltak jelentős változást.

2. Bevezetés

A tehéntejnek magas a tápértéke; többek között zsírokat, fehérjéket, szénhidrátokat, vitaminokat és ásványi anyagokat tartalmaz [1]. A tej összetételének vizsgálata a tejelő állományok higiéniai, táplálkozási és egészségügyi szempontjainak figyelemmel kísérésére céljából a tejgazdaságokban rutinszerű gyakorlat [2]. A tej összetételét számos tényező befolyásolhatja, többek között a laktációk száma, a laktáció stádiuma, az évszak, valamint a takarmányozási technológia is [3, 4, 5]. A tej összetétele tehát változhat a laktációk során, és a különböző környezeti tényezők kölcsönhatásainak eredményeként különbségek lehetnek különböző tejtermelő tehenészetek között is [6]. Dürr et al. szerint kiemelkedően fontos a tejhozamra és a tej összetételére vonatkozó eltérések okainak és következményeinek meghatározása érdekében adatbázisok létrehozása. Az adatbázisnak tartalmaznia kell ezen paraméterekre és a laktációkkal kapcsolatos eseményekre vonatkozó, egyedekre vonatkozó feljegyzéseket is [7].

A tej tápértéke, magas vízaktivitása és semleges pH-ja révén kitűnő táptalajként szolgál a különféle mikroorganizmusok számára, amelyek között patogén szervezetek is előfordulhatnak, például Campylobacter jejuni, Salmonella spp., Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Yersinia enterocolitica stb. [8, 9]. A tej elsődleges fertőződése során maguk a beteg állatok a fertőződés forrásai. A szisztémás, kórokozók szóródásával járó betegségben szenvedő tejelő állatok esetében a kórokozók ugyanis kiválasztódhatnak a tejjel. A másodlagos szennyeződéskor a tej kontaminációja környezeti eredetű. A helytelen fejési higiénia miatt a tej többek között az állatok bélsarától, illetve a fejéskor alkalmazott eszközöktől (fejőgépek, tejvezetékek, tejtároló tartályok) szennyeződhet [10]. Ahogy a tej a tejmedencébe, majd a bimbócsatornába kerül, különböző környezeti eredetű mikroorganizmussal fertőződhet, ezért az első tejsugarak baktérium-fertőzöttsége kiemelkedően magas. A fejés megkezdésekor célszerű ezért az első tejsugarakat a továbbiakban fejt tejtől elválasztani, majd annak megsemmisítéséről gondoskodni kell [11]. A tejben lévő baktériumszám csökkentésére leginkább hőkezelést alkalmaznak. A tej kezdeti mikrobiológiai állapota nemcsak az élelmiszer-biztonság szempontjából fontos, de befolyásolhatja az abból készült tejtermékek minőségét is [12].

A coliform baktériumok tőgygyulladást idézhetnek elő a tejtermelő állatokban. A coliform baktériumok által okozott tőgygyulladás csökkentheti a tejelő állatok tejtermelését, gazdasági veszteségeket okozva ezzel a tejtermelő telepeknek [13]. Ezeknek a baktériumoknak a jelenléte a környezetben általános, ezért jelenlétük az élelmiszerben környezeti szennyeződésre utalhat [14, 15].

A nyerstej számos forrásból szennyeződhet S. aureus-szal, például a környezetből, a fejők kezéről, fejőberendezésekről stb. [16]. A S. aureus okozta tőgygyulladás gazdasági kára abból következik, hogy a termelt tej mennyisége lecsökken, minősége leromlik, a benne mért szomatikus sejtszám megnövekszik, a gyengébb minőségű tej felvásárlási ára csökken, így a tejtermelők árbevétele is csökken [17]. A S. aureus elleni védekezés hatékony eszköze a megelőzés. A fertőződés a megfelelő tartási és fejési technológia betartásával, a gyakoribb légyirtással, a tőgybimbó elő- és utófertőtlenítésével, az egyszer használatos tőgytörlő papírok használatával és a laborvizsgálatok rendszeres elvégzésével előzhető meg [18].

A külső és belső tényezők a tej összetételét, és a nyerstej mikrobiológiai állapotát is befolyásolhatják. Utóbbit leginkább a tejjel közvetlenül érintkező felületek higiéniai állapota határozza meg [19]. Peles és munkatársai kutatásai során arra a megállapításra jutottak, hogy a különböző tehénlétszámú tejtermelő gazdaságokban a különféle tartási és fejési módszerek befolyásoló hatást gyakorolnak a tej mikrobiológiai minőségére [20]. Tessema a fajta, az állatok kora, a laktáció száma és a laktáció stádiuma, valamint a S. aureus előfordulásának a valószínűsége között keresett összefüggést.

Tanulmányában a két vizsgált szarvasmarhafajta esetében jelentős különbséget tapasztalt a S. aureus tejben való előfordulására vonatkozóan. A S. aureus nagyobb arányban fordult elő a keresztezett teheneknél, illetve az idősebb egyedek esetében [21]. Bytyqi és munkatársai a különböző fajták tejét vizsgálva nem tapasztaltak különbséget a kapott telepszámok között [22].

Bár magyar tanulmány kevesebb számban készült a témában, több külföldi közleményben vizsgálták, hogy vajon a laktációk száma, laktációk stádiuma befolyással van-e az állatok napi tejmennyiségére, a tej összetételére és mikrobiológiai paramétereire. Tessema szerint a S. aureus prevalenciájában jelentős különbség figyelhető meg aszerint, hogy az állatok hányadik laktációjukban vannak. Tanulmányában megállapította, hogy a S. aureus azoknál a több mint kétszer ellett tehenek tejében fordult elő gyakrabban, amelyek a California Mastitis Test-tel pozitívak voltak [21]. Tenhagen és munkatársai is úgy találták, hogy a S. aureus előfordulásának gyakorisága nő az állatok korával [23]. Ez összefüggésben állhat azzal, hogy a fejések alkalmával a fejőgép megsértheti a tőgybimbókat, így mikroorganizmusok kerülhetnek a környezetből a tőgybe [24]. Egy másik lehetséges ok az, hogy a tejelő állatok egészségügyi állapota azok életkora előrehaladtával romolhat, amelynek kedvezőtlen hatása lehet a tej szomatikus sejtszámára [25].

Vizsgálataink során a célunk az volt, hogy egy hazai nagyüzemi tejtermelő telepen megállapítsuk, hogy van-e különbség az egyszer és a többször ellett, valamint a laktáció különböző stádiumaiban lévő tehenek napi tejmennyiségében, illetve az egyszer és a többször ellett, valamint a laktáció különböző stádiumaiban lévő tehenektől származó tej összetételében (zsír- és fehérjetartalom) és mikrobiológiai paramétereiben (szomatikus sejtszám, összcsíraszám, coliform- és S. aureus-szám).

3. Anyag és módszer

3.1. A mintavétel helye és ideje

Vizsgálatainkba egy Hajdú-Bihar megyében (Magyarország) található tejtermelő telepet vontunk be. A telepen 440–450 holstein-fríz tehenet fejnek. A telepen mélyalmos tartásmódot és monodiétás takarmányozást alkalmaznak. A fejés fejőházban történik, a fejést követően nem végeznek utófertőtlenítést.

A számításokhoz felhasznált napi tejmennyiségre, zsír- és fehérjetartalomra, szomatikus sejtszámra vonatkozó adatok a befejési eredményekből, azaz az Állattenyésztési Teljesítményvizsgáló Kft. által havonta gyűjtött tejminták vizsgálati eredményeiből, a befejési eredményekből származnak. A számításokba 38 egyed valamennyi 2015. május-2020. január közötti befejési eredményét felhasználtuk. A számítások során összegeztük az említett időintervallum alatt a tehenek első laktációjára vonatkozó adatait (n=387), a tehenek 2-5. laktációjára vonatkozó adatait (n=446), továbbá a tehenek laktációjának korai stádiumára (100 nap alatt; n=275), közép stádiumára (100-200 nap; n=249) és a késői stádiumára (200 nap felett; n=309) vonatkozó adatokat.

A mikrobiológiai vizsgálatokat 2018. május és 2019. október között végeztük. A mikrobiológiai vizsgálatokhoz 38 véletlenszerűen kiválasztott, klinikailag egészséges egyedtől összesen 62 tejmintát vettünk. Aszerint, hogy a mintavétel során az állatok hányadik laktációs ciklusban, illetve a laktáció amely stádiumában voltak, a következő csoportokba soroltuk az egyedektől vett mintákat: a 15 egyszer ellett tehéntől 26 mintát, a 23 többször ellett (2-5 ellés) holstein-fríz tehéntől 36 mintát vettünk. Az összesen vett 62 mintából 23-t a laktáció korai stádiumában, 21 mintát a laktáció közép stádiumában, 18 mintát pedig a laktáció végén tartó tehenektől vettünk.

A tőgybimbók előfertőtlenítését, papírtörlővel való szárazra törlését és az első tejsugarak kifejését követően a tehenek mind a négy tőgynegyedéből 50 ml űrtartalmú, zárható steril műanyag mintavételi edényekbe vettünk mintákat. Az edényeket a mintavételt követő két órán belül hűtőtáskában szállítottuk a Debreceni Egyetem Élelmiszertudományi Intézet mikrobiológiai laboratóriumába. A mintákat a mintavételtől számított 24 órán belül feldolgoztuk.

3.2. Mikrobiológiai vizsgálatok

A tejminták előkészítését és az azt követő mikrobiológiai vizsgálatokat Petróczki és munkatársai által leírt eljárás szerint végeztük el [26]. A mintaelőkészítés az MSZ EN ISO 6887-1:2017 [27] szabvány alapján történt, a mintákat a vizsgálat kezdetéig 4 °C-on tároltuk, feldolgozásuk előtt pedig rázással homogenizáltuk. A hígítási sor elkészítéséhez peptonvizet használtunk, amelyet 8,5 g nátrium-klorid (VWR International Kft., Magyarország) és 1,0 g pepton (Merck Kft., Magyarország) 1000 ml desztillált vízben való feloldásával állítottunk elő.

A megfelelő mennyiségek (9-9 ml) kémcsőbe történő kimérését követően a hígítófolyadékot 30 percig 120 °C-on kuktában sterileztük, majd lehűtöttük, végül elkészítettük a decimális hígítási sort.

Az összcsíraszám meghatározása az MSZ EN ISO 4833-1:2014 [28] szabvány szerint történt, amely tejporral kiegészített tripton-glükóz-élesztő (Plate Count Agar, PCA) agar táptalaj (Biolab Zrt., Magyarország) használatát írja elő. Az előírt lemezöntéses módszer végrehajtása után a lemezeket 72 órán át 30 °C-on inkubáltuk.

A coliform baktériumok mennyiségének meghatározását az ISO 4832:2006 [29] szabvány szerint lemezöntéses módszerrel végeztük, steril kristályibolya-epe-laktóz (Violet Red Bile Lactose, VRBL) agart (Biolab Zrt., Magyarország) használatával. Az inkubálás 30 °C-on történt 24 órán át tartott.

A S. aureus meghatározását az MSZ EN ISO 6888-1:2008 [30] szabványnak megfelelően szélesztéses módszerrel hajtottuk végre, amelyhez tojássárga-tellurit emulzióval (LAB-KA Kft., Magyarország) kiegészített Baird-Parker agart (BPA) (Biolab Zrt., Magyarország) használtunk. Az inkubálás 37 °C-on 48 órán át tartott. A S. aureust a többi Staphylococcus fajtól latex agglutinációs teszt (Prolex Staph Xtra Kit, Ferol Kft., Magyarország) alkalmazásával különítettük el.

3.3. Statisztikai analízis

Vizsgálati eredményeink elemzéséhez, leíró statisztika kiszámításához, valamint a mikroorganizmusok mennyiségének logaritmikus transzformációjához, a t-tesztek és a varianciaanalízis elvégzéséhez az SPSS v.22.0 [31] szoftvert alkalmaztuk.

A laktáció-szám esetében a változók összehasonlítását párosítatlan t-próbával, illetve nem paraméteres Mann-Whitney teszttel végeztük, a laktáció-stádium esetében pedig az összehasonlítást egytényezős varianciaanalízissel, illetve nem paraméteres Kruskal-Wallis teszttel végeztük el. Mivel az összcsíraszám, a coliform-szám és a szomatikus sejtszám több esetben nem bizonyult normál eloszlású változónak, e paraméterek esetében logaritmikus transzformációt alkalmaztunk. A statisztikai elemzések során a P<0,05 értéket szignifikáns különbségnek értékeltük.

4. Eredmények

4.1. A laktációszám hatása a tejhozamra, a nyers tej összetételére és mikrobiológiai paramétereire

Az egyszer és a többször ellett tehenek napi tejmennyiségének és az általuk termelt tej zsír- és fehérjetartalmának, továbbá a szomatikus sejtszámának, összcsíraszámának, coliform- és S. aureus-számának átlag és szórásértékeit az 1. táblázat tartalmazza. A vizsgálatra kiválasztott teheneket laktációjuk (egyben ellésük) száma alapján az egyszer, illetve a többször ellett egyedek csoportjaiba soroltuk. Az egyszer ellett tehenek esetében az átlagos tejmennyiség 25,67 kg/nap volt, míg a többször ellett tehenek esetében 31,04 kg/nap. A különbség szignifikáns (P<0,05), ezzel saját kísérleteinkkel is megerősítettük Bondan és munkatársai, valamint Yang és munkatársai megállapítását, miszerint a többször ellett tehenek által leadott napi tejmennyiség több az egyszer ellett tehenekéhez képest [5, 32]. Gurmessa és Melaku keresztezett holstein-fríz tehenek esetében vizsgálták többek között az ellésszám befolyását a tejmennyiségre, azonban nem tapasztaltak különbséget az egyszer és a többször ellett tehenek napi tejmennyisége között [33]. Pratap és kutatócsoportja az egyszer és a többször ellett tehenek napi átlagos tejmennyiségét (6,43±1,39 és 5,89±2,37 l/nap) vizsgálva szintén nem tapasztalt különbséget [34].

A kutatómunkánk során kiválasztott tehenek első laktációja során a tej átlag zsírtartalma 3,74±0,40% volt, míg a kettő, vagy annál több laktáció során vett tejmintákban az átlag zsírtartalom 3,75±0,36% volt. A különbséget nem találtuk szignifikánsnak (P>0,05). Saját eredményeinkhez hasonlóan Gurmessa és Melaku, továbbá Pratap és munkatársai sem tapasztaltak különbséget az egyszer, illetve többször ellett, keresztezett holstein-fríz tehenek tejének átlag zsírtartalma között [33, 34]. Bondan és csoportja viszont azt tapasztalta, hogy a laktációszám befolyásolta a tej zsírtartalmát holstein-fríz tehenekben. Míg az első laktációs tehenek esetében a zsírtartalom 3,47±0,67% volt, a 2-3. laktációs tehenek esetében, valamint a legalább négyszer ellett tehenek esetében 3,43±0,68% és 3,41±0,67% [5]. Shuiep és munkacsoportja a Szudánban készült tanulmányukban helyi és keresztezett tehenek esetében vizsgálták a tej zsírtartalmának változását a laktáció-számmal. A helyi tehenek esetében a negyedik laktációs (többször ellett) teheneknél alacsonyabb volt a tej zsírtartalma (4,82±0,55%), mint a kevesebbszer ellett (1:5,16±0,32; 2:5,22±0,34; 3:5,14±0,34) tehenek esetében. A keresztezett teheneknél nem tapasztaltak különbséget [6]. Yang és munkatársai a kutatásuk során ezzel szemben azt állapították meg, hogy az első laktációs holstein-fríz tehenek esetében volt kevesebb a tej zsírtartalma (3,88%) [32]. A tanulmányunk, illetve a más szakirodalmak változatos eredményei alapján arra a következtetésre jutottunk, hogy a laktációszámon kívül más egyéb tényező is befolyással lehet a tej zsírtartalmára.

Az általunk kiválasztott holstein-fríz tehenek első laktációja során a tej átlag fehérjetartalma 3,24±0,19%, míg a kettő, vagy annál több laktációjuk során vett tejmintákban az átlag fehérjetartalom 3,31±0,16% volt, a különbség nem jelentős (P>0,05). Ez egybevág Gurmessa és Melaku, valamint Pratap és munkatársai megállapításaival, ugyanis a szerzők sem tapasztaltak különbséget az egyszer, illetve többször ellett tehenek tejének átlag fehérjetartalma között [33, 34]. Bondan kutatócsoportja ezzel szemben úgy találta, hogy a laktációszám befolyásolta a tej fehérjetartalmát a holstein-fríz tehenekben. Míg az első laktációs tehenek esetében a fehérjetartalom 3,24±0,37% volt, a 2-3. laktációs tehenek esetében, valamint a legalább négyszer ellett tehenek esetében 3,23±0,38% és 3,19±0,37% [5]. A tej fehérjetartalmának változását a laktáció-számmal Shuiep kutatócsoportja is vizsgálta. A helyi tehenek esetében a negyedik laktációs (többször ellett) időszakba lépett teheneknél alacsonyabb volt a tej fehérjetartalma (3,67±0,19%), mint a kevesebbszer ellett (1:4,01±0,11; 2:3,82±0,12; 3:3,84±0,12) tehenek esetében. A keresztezett teheneknél nem tapasztaltak különbséget [6].

Eredményeink szerint az egyszer ellett tehenek tejében az átlag szomatikus sejtszám [242,2×103 (5,12±0,42 lg) sejt/ml] kevesebb (P<0,05), mint a többször ellett tehenek tejében [356,3×103 (5,39±0,39 lg) sejt/ml]. Az értékek átlagai egyik esetben sem haladták meg a 853/2004/EK rendeletben meghatározott határértéket [M=400,0×103 (5,60 lg) tke/ml] [35]. A hazai tejtermelő telepen kapott eredmények egybevágnak a vonatkozó szakirodalmakkal.

Mikó és munkatársai szerint a laktáció számának növekedésével a tej szomatikus sejtszáma is növekedhet [25]. Ezt a megállapítást Yang és csoportja is tapasztalta [32]. Sheldrake és munkatársai szignifikáns kapcsolatot figyeltek meg az ellésszám és a szomatikus sejtszám között. Megállapították, hogy az ellések számának emelkedésével az egészséges állatok tőgynegyedeiben kisebb mértékű változás történt, azonban a S. aureus-szal fertőzött tőgynegyedek esetében jelentősen nőtt a szomatikus sejtszám [36]. Bondan kutatócsoportja az tapasztalta, hogy a vizsgált holstein tehenek laktációszámának növekedésével a tejben a szomatikus sejtszám is növekedő tendenciát mutatott. Míg az egyszer ellett tehenek esetében az átlag szomatikus sejtszám 4,83±1,73 lg sejt/ml volt, a két-háromszor ellett tehenek, valamint a négy, vagy annál többször ellett tehenek esetében 5,31±1,72 és 5,84±1,62 lg sejt/ml [5].

Az egyszer ellett, azaz első laktációs holstein-fríz tehenektől vett tejmintákban az átlag összcsíraszám 5,1×103 (3,36±0,58 lg) tke/ml volt és 4,6×103 (3,30±0,59 lg) tke ml a többször ellett tehenektől vett tejmintákban azonban a különbség nem volt szignifikáns (P>0,05).

A többször ellett tehenek tejében az átlag coliform-szám [1,1×103 (1,35±1,20 lg) tke/ml] viszont több (P<0,05) volt, mint az egyszer ellett tehenek tejében mért átlag telepszám [1,1×101 (0,65±0,61) lg) tke/ml]. Tenhagen és munkatársai szintén klinikailag egészséges teheneket vontak be a vizsgálatukba, amely során megállapították, hogy a coliform baktériumok bár nagyobb arányban fordultak elő a többször ellett tehenek tejében, nem volt tapasztalható különbség [23].

S. aureus a 26 közül csak egyetlen, egyszer ellett egyedtől származó tejmintában fordult elő, 5,0×101 (1,70 lg) tke/ml mennyiségben, a vizsgált 36 többször ellett egyedtől vett minta közül pedig nyolc egyedi tejmintában tudtuk kimutatni. Ezekben a mintákban az átlag S. aureus szám 1,5×102 (1,92±0,56 lg) tke/ml volt. Az értékek nem haladják meg a 4/1998 (XI. 11.) EüM rendeletben meghatározott határértéket [M=5,0×102 (2,70 lg) tke/ml] [37]. Azon egyedek esetében, amelyeknek tejében a mikrobiológiai vizsgálatok során kimutatható volt a S. aureus, a befejési adatok alapján az átlag szomatikus sejtszámuk 44,3×103 (4,65 lg) sejt/ml és 357,2×103 (5,55 lg) sejt/ml között alakult. Tessema a tanulmányában szintén megállapította, hogy a S. aureus prevalenciája nagyobb a többször (azaz több mint kétszer) ellett tehenek (amelyek a California Mastitis Testtel pozitívak voltak) esetében [21]. Tenhagen és munkatársai szerint a S. aureus előfordulása növekedik az állatok életkorával és a laktáció stádiumával [23].

1. táblázat. Az egyszer és többször ellett tehenek napi tejmennyisége és az általuk termelt tej összetétele és mikrobiológiai tulajdonságai

a, b A táblázat azonos soraiban a különböző betűkkel jelölt értékek szignifikánsan különböznek (P<0,05)

4.2. A laktáció stádium hatása a tejhozamra, a nyers tej összetételére és mikrobiológiai paramétereire

A korai, közép és késői laktációs stádiumban lévő tehenek napi tejmennyiségének és az általuk termelt tej zsír- és fehérjetartalmának, továbbá a szomatikus sejtszámának, összes csíraszámának, coliform- és S. aureus-számának átlag és szórásértékeit a 2. táblázat tartalmazza. A vizsgálatra kiválasztott teheneket laktációjuk stádiuma alapján korai, közép és késői laktáció stádiumú egyedek csoportjaiba soroltuk. Az egyedek napi tejmennyiségének a laktáció stádiumával való változásának a vizsgálata során igazolódott az a szakirodalomban is megtalálható megállapítás, miszerint a laktáció vége felé haladva a napi leadott tejmennyiség csökken. Míg a laktációjuk elején lévő tehenek átlag napi tejmennyisége 32,10±4,73 kg/nap, a laktáció közepén tartó teheneké 29,08±5,09 kg/nap, a laktáció végén tartó teheneké 23,36±3,63 kg/nap. A különbség szignifikáns (P<0,05). Bondan és csoportja hasonló megállapításra jutottak a tanulmányukban. Az általuk vizsgált holstein-fríz tehenek laktációjának 6. és 60. nap közötti időszakában az átlagos tejmennyiség 29,4±8,72 l/tehén/nap volt; azon teheneknek, amelyek laktációjuk 61-120. napján tartottak 29,2±8,66 l/tehén/nap volt; a laktáció 121. és 220. napja közötti intervallumban a tehenek tejmennyisége 26,2±8,01 l/tehén/nap volt, a laktáció végén (>220 nap) pedig 22,0±7,49 l/tehén/nap [5].

Gurmessa és Melaku, valamint Pratap és munkatársai ugyancsak azt tapasztalták, hogy a laktáció elején nagyobb volt az állatok napi tejmennyisége (6,81±1,45 l/nap), mint a laktáció végén (5,48±0,05 l/nap). Vizsgálataik során a laktáció közepén tartó keresztezett holstein-fríz tehenek napi tejmennyisége (7,17±0,05 liter) volt a legnagyobb [33, 34]. Auldist és munkatársai szerint a laktáció-stádium tejmennyiségre gyakorolt hatása (például csökkenése) az emlőmirigyen belüli szekréciós sejtek számának és aktivitásának fiziológiai okból eredő változásából eredhet [2].

A vizsgált egyedek tejének zsírtartalma változást mutat a laktáció vége felé haladva. A laktáció elején, illetve közepén tartó tehenek tejének zsírtartalma átlagosan 3,65±0,43% és 3,59±0,41% volt, amelyek kevesebbnek (P<0,05) mutatkoztak, mint a laktáció végén járó tehenek tejében mért zsírtartalom (3,99±0,47%). A laktáció végén a tejzsír koncentrációjának növekedése összefüggésbe hozható a laktáció előrehaladásával tapasztalható tejhozam-csökkenéssel, ugyanis a csökkenő tejmennyiségnek koncentráló hatása lehet a tej összetételére nézve [2]. A tej zsírtartalma Gurmessa és Melaku közleménye szerint is változik az állatok laktációjának három stádiumában. A laktációjuk elején és végén tartó tehenek esetében a tej átlagos zsírtartalma (4,46±1,44% és 4,46±1,44%) jelentősen magasabb azon tehenek tejéhez (3,70±0,89%) képest, amelyek a laktáció közepén járnak [33]. Bondan és munkatársai közleményében az áll, hogy a tej zsírtartalma a laktáció végén (>200 nap) nagyobb (3,55±0,67%), mint a laktáció korábbi stádiumaiban. Ugyanakkor azt is tapasztalta, hogy a mért átlagos zsírtartalom (3,30±0,66%) a tehenek laktációjának 61. és 120. napja közötti időintervallumban volt a legkevesebb. A laktáció 6. és 60., valamint a 121. és 220. napjai közötti időintervallumában 3,40±0,65% és 3,40±0,66% átlag zsírtartalmat mértek [5]. Shuiep és munkatársai a szudáni helyi és keresztezett tehenek esetében vizsgálták a tej zsírtartalmának változását a laktáció stádiummal. A helyi fajta esetében nem volt különbség a zsírtartalmat illetően a laktáció elején (5,31±0,51%), közepén (4,67±1,56%) és végén (5,28±0,75%). A keresztezett teheneket tekintve azonban a laktáció végén több volt a zsírtartalom (4,45±1,43%), mint a laktáció elején (3,41±1,09%) és közepén (3,33±1,05%) [6].

A zsírtartalomhoz hasonlóan a fehérjetartalom esetében is változás figyelhető meg az időben a laktáció vége felé haladva. A laktáció elején mért átlagos fehérjetartalom 3,08±0,15%, a laktáció közepén 3,20±0,19%, a laktáció végén 3,56±0,20%, a különbség szignifikáns (P<0,05). Bondan és munkatársai hasonló megállapításra jutottak: a laktáció végén (>200 nap) nagyobb fehérjetartalmat (3,41±0,36%) mértek, mint a laktáció korábbi stádiumaiban. Azt is tapasztalták továbbá, hogy a mért átlagos fehérjetartalom (3,03±0,31%) a tehenek laktációjának 61. és 120. napja közötti időintervallumban volt a legkevesebb. A laktáció 6. és 60., valamint a 121. és 220. napok közötti időintervallumban 3,05±0,36% és 3,18±0,32% átlag fehérjetartalmat mértek [5]. Gurmessa és Melaku, valamint Pratap kutatócsoportja nem tapasztaltak különbséget a fehérjetartalmat illetően a laktáció elején (3,55±1,43%), közepén (3,17±0,15%) és végén (3,33±0,16%) lévő tehenek esetében [33, 34].Shuiep és munkatársai a szudáni helyi és keresztezett teheneket illetően vizsgálták a tej fehérjetartalmának változását a laktáció stádiummal. A helyi fajta esetében a laktáció elején (3,87±0,52%) és közepén (3,91±0,18%) több volt a fehérjetartalom az állatok tejében, mint a laktáció végén (3,67±0,17%). A keresztezett tehenek esetében nem volt különbség a zsírtartalmat illetően a laktáció elején (3,67±0,17%), közepén (3,69±0,16%) és végén (3,63±0,22%) [6].

A kutatómunkánk során kiválasztott tehenek laktációjának korai stádiumában az átlagos szomatikus sejtszám 195,1×103 (5,07±0,43 lg) sejt/ml, a laktáció közepén 370,6×103 (5,28±0,50 lg) sejt/ml, a késői laktációs stádiumban 336,4×103 (5,33±0,41 lg) sejt/ml volt. A késői laktációs stádiumban lévő egyedek tejében magasabb (P<0,05) volt a szomatikus sejtszám, mint a laktáció elején lévő tehenek esetében. A laktáció előrehaladásával a szomatikus sejtszám Bondan és munkatársai szerint is növekedő tendenciát mutat. Míg azon holstein-fríz tehenek tejében, amelyeknek laktációja 6. és 60. nap között tartott, az átlagos szomatikus sejtszám 4,79±1,90 lg sejt/ml volt, a laktáció 61. és 120. napja között 4,89±1,90 lg sejt/ml, a laktáció 121. és 220. napja között 5,21±1,75 lg sejt/ml, a 220. napnál tovább tartó laktáció esetében pedig ez a paraméter a vizsgált tehenek tejében 5,53±1,53 lg sejt/ml volt [5].

A holstein-fríz tehenek laktációjának stádiumaiban az összes csíraszámot is meghatároztuk. A laktáció elején az átlagos összes csíraszám 6,8×103 (3,42±0,67 lg) tke/ml, a laktáció közepén 4,4×103 (3,39±0,46 lg) tke/ml, a laktáció végén 2,7×103 (3,13±0,56 lg) tke/ml volt. A kapott összes csíraszám-értékek között nem találtunk szignifikáns különbséget (P>0,05).

A coliform baktériumok számát illetően a legnagyobb telepszámot [1,3×103 (1,30±1,23 lg) tke/ml] a tehenek laktációjának elején vett mintákból mértük, a legkevesebb átlagos coliform- számot [2,2×101 (0,76±0,79 lg) tke/ml] pedig a laktáció közepén vett mintákban mutattuk ki. A laktáció végén vett mintákban az átlagos coliform-szám 1,50×102 (0,90±0,94 lg) tke/ml volt. Az eredmények között nem tapasztaltunk szignifikáns különbséget (P>0,05).

S. aureus a 62 egyedi tejmintából összesen 9 (14,52%) mintában fordult elő átlagosan 1,4×102 (1,89±0,53 lg) tke/ml telepszámban. Abban a hat (9,68%) mintában, amelyek a laktációjuk elején tartó tehenektől származtak, az átlagos S. aureus-szám 1,2×102 (1,81±0,56 lg) tke/ml volt, a laktáció közepén lévő egy (1,61%) állat esetében a S. aureus szám 8,2×101 (1,91 lg) tke/ml volt, a laktáció végén lévő két (3,23%) tehén esetében pedig 2,4×102 (2,15±0,70 lg) tke/ml.

2. táblázat. A korai, közép és késői laktációs stádiumban lévő tehenek napi tejmennyisége és az általuk termelt tej összetétele és mikrobiológiai tulajdonságai

a, b, c A táblázat azonos soraiban a különböző betűkkel jelölt értékek szignifikánsan különböznek (P<0,05)

5. Következtetések

Egy hazai tejgazdaságban végzett kutatómunkánk során igazoltuk, hogy nagyüzemi tartási körülmények között az egyszer ellett tehenek esetében az átlag napi tejmennyiség szignifikánsan kevesebb (P<0,05), mint a többször ellett tehenek esetében. Ennek valószínűleg az az oka, hogy testük fejlődéséhez az első laktációjukban lévő teheneknek van több aminosavra és zsírra szükségük a már több laktációs időszakon átesett állatokhoz képest [38].

A tej zsír- és fehérjetartalmát illetően nem volt szignifikáns különbség az egyszer és a többször ellett tehenek között. Mivel a szakirodalomban a tanulmányunkban kapott eredményekkel megegyező, illetve azoktól eltérő megállapításokkal is találkoztunk, feltételezzük, hogy más tényező (pl. fajta, évszak stb.) is befolyásolja a tej zsír- és fehérjetartalmát, azonban ezeknek a tényezőknek a feltérképezése nem képezte célját a tanulmányunknak. Shuiep és munkatársai közleményükben például két különböző szarvasmarhafajta esetében eltérő eredményekről számolnak be a tej zsír- és fehérjetartalmának a laktációszámmal történő változását vizsgálva [6].

Mérési eredményeink alapján megállapítottuk, hogy a többször ellett tehenektől vett tejmintákban az első laktációs tehenektől vett tejmintákhoz képest szignifikánsan nagyobb (P<0,05) volt a szomatikus sejtszám, illetve a coliform baktérium-szám, de a S. aureus is nagyobb arányban fordult elő. Annak oka, hogy a többször ellett tehenek esetében a mikroorganizmusok nagyobb mennyiségben mérhetők a tejmintákban, egyrészt valószínűleg az, hogy a tőgybimbók a laktációk során károsodhattak (többek között például a fejőgép miatt), amely növelhette a mikroorganizmusok tőgybe jutásának esélyét [24]. Másik oka az lehet, hogy a kor előrehaladtával, illetve a laktációk számának növekedésével a tejelő állatok kondíciója gyengülhetett, amely kedvezőtlenül hathatott például a tej szomatikus sejtszámára [25].

Azt is igazoltuk, hogy a laktáció stádiumaiban a napi leadott tejmennyiség esetén csökkenő tendenciát lehet megfigyelni, viszont a zsír- és fehérjetartalom növekedést mutat. Ez feltételezhetően a csökkenő tejmennyiség koncentráló hatásának tudható be.

A laktáció különböző stádiumaiból vett tejmintákban nem volt tapasztalható különbség az összes csíraszám és a coliform baktériumok telepszámait illetően, azonban a laktáció késői stádiumában a szomatikus sejtszám növekedést mutatott.

6. Köszönetnyilvánítás

A publikáció elkészítését az EFOP-3.6.3-VEKOP-16-2017-00008 számú projekt támogatta. A projekt az Európai Unió támogatásával, az Európai Szociális Alap társfinanszírozásával valósult meg.

Köszönettel tartozom a tejtermelő telep vezetőinek és dolgozóinak a segítőkész közreműködésükért.

7. Irodalom

[1] Hill B., Smythe B., Lindsay D., Shepherd J (2012): Microbiology of raw milk in New Zealand. International Journal of Food Microbiology 157 2 pp. 305-308. https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2012.03.031

[2] Auldist M. J., Walsh B. J., Thomson N. A. (1998): Seasonal and lactational influences on bovine milk composition in New Zealand. Journal of Dairy Research 65 (3) pp. 401-411. https://doi.org/10.1017/S0022029998002970

[3] Heck J. M. L., van Valenberg H. J. F., Dijkstra J., van Hooijdonk A. C. M. (2009): Seasonal variation in the Dutch bovine raw milk composition. Journal of Dairy Science 92 (10) pp. 4745-4755. https://doi.org/10.3168/jds.2009-2146

[4] Lambertz C., Sanker C., Gauly M. (2014): Climatic effects on milk production traits and somatic cell score in lactating Holstein-Friesian cows in different housing systems. Journal of Dairy Science 97 (1) 3 pp. 19-329. https://doi.org/10.3168/jds.2013-7217

[5] Bondan C., Folchini J. A., Noro M., Quadros D. L., Machado K. M., González F. H. D. (2018): Milk composition of Holstein cows: a retrospective study. Ciência Rural 48 (12) pp. 1-8. https://doi.org/10.1590/0103-8478cr20180123

[6] Shuiep E. S., Eltaher H. A., El Zubeir I. E. M. (2016): Effect of Stage of Lactation and order of Parity on Milk Composition and Daily Milk Yield among Local and Crossbred Cows in South Darfur State, Sudan. SUST Journal of Agricultural and Veterinary Sciences (SJAVS) 17 (2) pp. 86-99.

[7] Dürr J. W., Ribas N. P., Costa C. N., Horst J. A., Bondan C. (2011): Milk recording as an indispensable procedure to assure milk quality. Revista Brasileira Zootecnia 40 pp. 76-81.

[8] Quigley L., O’sullivan O., Beresford T. P., Ross R. P., Fitzgerald G. F., Cotter P. D. (2011): Molecular approaches to analysing the microbial composition of raw milk and raw milk cheese. International Journal of Food Microbiology 150 (2-3) pp. 81-94. https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2011.08.001

[9] Claeys W. I., Cardoen S., Daube G., De Block J., Dewettinck K., Dierick K., De Zutter L., Huyghebaert A., Imberechts H., Thiange P., Vandenplas Y., Herman L. (2013): Raw or heated cow milk composition: Review of risks and benefits. Food Control 31 (1) pp. 251-262. https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2012.09.035

[10] Laczay P., Lehel J., Lányi K., László N. (2016): A nyers tejben potenciálisan jelen levő kórokozók közegészségügyi jelentősége. Magyar Állatorvosok Lapja 138 pp. 231-242.

[11] Laczay P. (2008): Élelmiszer-higiénia - Élelmiszerlánc-biztonság. Mezőgazda Kiadó, Budapest.

[12] Cilliers F. P., Gouws P. A., Koutchma T., Engelbrecht Y., Adriaanse C., Swart P. (2014): A microbiological, biochemical, and sensory characterisation of bovine milk treated by heat and ultraviolet (UV) light for manufacturing Cheddar cheese. Innovative Food Science & Emerging Technologies 23 pp. 94-106. https://doi.org/10.1016/j.ifset.2014.03.005

[13] Mbuk E. U., Kwaga J. K. P., Bale J. O. O., Boro L. A., Umoh J. U. (2016): Coliform organisms associated with milk of cows with mastitis and their sensitivity to commonly available antibiotics in Kaduna State, Nigeria. Journal of Veterinary Medicine and Animal Health 8 (12) pp. 228-236. https://doi.org/10.5897/JVMAH2016.0522

[14] Altalhi A. D., Hassan S. A. (2009): Bacterial quality of raw milk investigated by Escherichia coli and isolates analysis for specific virulence-gene markers. Food Control 20 (10) pp. 913-917. https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2009.01.005

[15] Mhone T. A., Matope G., Saidi P. T. (2011): Aerobic bacterial, coliform, Escherichia coli and Staphylococcus aureus counts of raw and processed milk from selected smallholder dairy farms of Zimbabwe. International Journal of Food Microbiology 151 (2) pp. 223-228. https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2011.08.028

[16] Markus G. (2001): A tejelő tehenek tőgygyulladása III. MezőHír. 9

[17] Ózsvári L., Fux A., Illés B. CS., Bíró O. (2003): A Staphylococcus aureus tőgygyulladás által okozott gazdasági veszteségek számszerűsítése egy nagyüzemi holstein-fríz tehenészetben. Magyar Állatorvosok Lapja 125 pp. 579-584.

[18] Rosengren Å., Fabricius A., Guss B., Sylvén S., Lindqvist R (2010): Occurrence of foodborne pathogens and characterization of Staphylococcus aureus in cheese produced on farm-dairies. International Journal of Food Microbiology 144 (2) pp. 263-269. https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2010.10.004

[19] Anderson D., Dulmage D., McDougall M., Séguin G. (2003): General guidelines for effective dairy equipment cleaning. https://www.milk.org/Corporate/pdf/Farmers-UdderEquipmentCleaning.pdf (Hozzáférés: 21. 02. 2020.)

[20] Peles F., Máthéné Sz. Zs., Béri B., Szabó A. (2008): A tartástechnológia hatása a nyers tej mikrobiológiai állapotára. Agrártudományi Közlemények 31 pp. 67-75. https://doi.org/10.34101/actaagrar/31/3009

[21] Tessema F. (2016): Prevalence and Drug Resistance Patterns of Staphylococcus Aureus in Lactating Dairy Cow’s Milk in Wolayta Sodo, Ethiopia. EC Veterinary Science 2 (5) pp. 226-230.

[22] Bytyqi H., Vehapi I., Rexhepi S., Thaqi M., Sallahi D., Mehmeti I. (2013): Impact of Bacterial and Somatic Cells Content on Quality Fresh Milk in Small-Scale Dairy Farms in Kosovo. Food and Nutrition Sciences 4 (10) pp. 1014-1020. https://doi.org/10.4236/fns.2013.410132

[23] Tenhagen B. A., Köster G., Wallmann J., Heuwieser W. (2006): Prevalence of Mastitis Pathogens and Their Resistance Against Antimicrobial Agents in Dairy Cows in Brandenburg, Germany. Journal of Dairy Science 89 (7) pp. 2542-2551. https://doi.org/10.3168/jds.S0022-0302(06)72330-X

[24] Hamann J., Mein G. A., Wetzel S. (1993): Teat tissue reactions to milking: effects of vacuum level. Journal of Dairy Science 76 pp. 1040-1046. https://doi.org/10.3168/jds.S0022-0302(93)77432-9

[25] Mikó E., Baranyi A., Gráff M. (2015): Analysis of somatic cells in cow’s milk. Lucrări Ştiinţifice 17 (1) pp. 290-293.

[27] Magyar Szabványügyi Testület (MSzT) (2017): Élelmiszerek és takarmányok mikrobiológiája. A vizsgálati minták, az alapszuszpenzió és a decimális hígítások elkészítése mikrobiológiai vizsgálathoz. 1. rész: Az alapszuszpenzió és a decimális hígítások elkészítésének általános szabályai. Magyar szabvány MSZ EN ISO 6887-1:2017. Magyar Szabványügyi Testület, Budapest.

[26] Petróczki F. M., Tonamo T. A., Béri B., Peles F. (2019): The effect of breed and stage of lactation on the microbiological status of raw milk. Acta Agraria Debreceniensis 1 pp. 37-45. https://doi.org/10.34101/actaagrar/1/2367

[28] Magyar Szabványügyi Testület (MSzT) (2014): Az élelmiszerlánc mikrobiológiája. Horizontális módszer a mikroorganizmusok számlálására. 1. rész: Telepszámlálás 30 °C-on lemezöntés módszerrel. Magyar szabvány MSZ EN ISO 4833-1:2014. Magyar Szabványügyi Testület, Budapest.

[29] International Organization for Standardization (ISO) (2006): Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for the enumeration of coliforms - Colony-count technique. ISO 4832:2006

[30] Magyar Szabványügyi Testület (MSzT) (2008): Élelmiszerek és takarmányok mikrobiológiája. Horizontális módszer a koagulázpozitív sztafilokokkuszok (Staphylococcus aureus és más fajok) számának meghatározása. 1. rész: Baird-Parker-agar táptalajos eljárás. Magyar szabvány MSZ EN ISO 6888-1:2008. Magyar Szabványügyi Testület, Budapest.

[31] SPSS (2013): SPSS 22.0 for Windows. SPSS Inc., Chicago, IL, USA. Copyright © SPSS Inc., 1989-2013.

[32] Yang L., Yang Q., Yi M., Pang Z. H., Xiong B. H. (2013): Effects of seasonal change and parity on raw milk composition and related indices in Chinese Holstein cows in northern China. Journal of Dairy Science 96 (11) pp. 6863-6869. https://doi.org/10.3168/jds.2013-6846

[33] Gurmessa J., Melaku A. (2012): Effect of Lactation Stage, Pregnancy, Parity and Age on Yield and Major Components of Raw Milk in Bred Cross Holstein Friesian Cows. World Journal of Dairy & Food Sciences 7 (2) pp. 146-149.

[34] Pratap A., Verma D. K., Kumar P., & Singh A. (2014): Effect of Pregnancy, Lactation Stage, Parity and Age on Yield and Components of Raw Milk in Holstein Friesian Cows in organized Dairy form in Allahabad. IOSR Journal of Agriculture and Veterinary Science (IOSR-JAVS) 7 (2) pp. 112-115. https://doi.org/10.9790/2380-0721112115

[35] 853/2004/EK: Az Európai Parlament és a Tanács 853/2004/EK rendelete az állati eredetű élelmiszerek különleges higiéniai szabályainak megállapításáról

[36] Sheldrake R. F., Hoare R. J. T., McGregor G. D. (1983): Lactation Stage, Parity, and Infection Affecting Somatic Cells, Electrical Conductivity, and Serum Albumin in Milk. Journal of Dairy Science 66 pp. 542-547. https://doi.org/10.3168/jds.S0022-0302(83)81823-2

[37] 4/1998. (XI. 11.) EüM rendelet az élelmiszerekben előforduló mikrobiológiai szennyeződések megengedhető mértékéről

[38] Oltner R., Emanuelson M., Wiktorsson H. (1985): Urea concentrations in milk in relation to milk yield, live weight, lactation number and amount and composition of feed given to dairy cows. Livestock Production Science 12 (1) pp. 47-57. https://doi.org/10.1016/0301-6226(85)90039-9

Tovább a cikk olvasásához


Serratia fajok jellemzése, valamint Serratia marcescens kvalitatív kimutatása nyers és pasztőrözött tejből polimeráz láncreakción alapuló vizsgálati módszerrel

Cikk letöltése PDF formátumban

Serratia fajok jellemzése, valamint Serratia marcescens kvalitatív kimutatása nyers és pasztőrözött tejből polimeráz láncreakción alapuló vizsgálati módszerrel

DOI: https://doi.org/10.52091/EVIK-2021/2-4-HUN

Érkezett: 2020. július – Elfogadva: 2020. december

Szerzők

1 Magyar Tejgazdasági Kísérleti Intézet Kft., Mosonmagyaróvár
2 Széchenyi István Egyetem, Wittmann Antal Növény-, Állat- és Élelmiszer-tudományi Multidiszciplináris Doktori Iskola, Mosonmagyaróvár
3 Széchenyi István Egyetem, Mezőgazdaság- és Élelmiszertudományi Kar, Élelmiszertudományi Tanszék, Mosonmagyaróvár

Kulcsszavak

nozokomiális fertőzés, Serratia fajok, Serratia marcescens, patogén, prodigiozin, pigment, polimeráz láncreakció (PCR), élelmiszer-diagnosztika

1. Összefoglalás

A Serratia fajok elsősorban nozokomiális (kórházhigiénés fertőzés – a Szerk.) fertőzőként ismert opportunista patogén mikroorganizmusok, amelyek élelmiszer-minőségi elváltozásokat is okozhatnak. Az extracelluláris pigment-termelő Serratia marcescens tehéntejben való megjelenése annak piros elszíneződését okozza, kihívások elé állítva a tejipart és az élelmiszer-minősítő laboratóriumokat. A baktérium kimutatása hagyományos mikrobiológiai módszereken alapuló eljárásokkal idő- és munkaigényes, ezen túlmenően sok esetben nem is vezet eredményre, a kísérő mikroflóra kompetitív gátló hatása miatt. A vonatkozó szakirodalom elemzését követően a S. marcescens kimutatása kapcsán publikált végpont PCR módszereket és alkalmazott primereket in silico és in vitro vizsgálatban értékeltük, majd az eljárást üzemi tejmintákon teszteltük. A módszer alkalmazásával összesen 60 db nyers, illetve pasztőrözött tejmintát vizsgáltunk meg, amelyeknek több mint felét (32 db-ot) azonosítottuk S. marcescens pozitívként. Munkánk jelentőségét legfőképp a publikált vizsgálati módszerek élelmiszeripari gyakorlatban való alkalmazása adja. Eredményeink felhívják a figyelmet e baktériumfaj detektálásának a fontosságára.

2. Bevezetés és irodalmi áttekintés

Napjainkban az élelmiszerek kifogástalan minősége és hosszú eltarthatósági ideje a vásárlók által támasztott alapkövetelmény. Ennek megfelelően fokozódik az igény az egyre gyorsabb, pontosabb, megbízhatóbb élelmiszer-diagnosztikai eljárások iránt is. A molekuláris diagnosztikai módszerek ezzel összefüggésben mind nagyobb teret nyernek, például a kórokozó mikroorganizmusok gyors kimutatásában. Számos gyártó állít elő polimeráz láncreakción (PCR) alapuló, patogén mikrobák azonosítására alkalmas diagnosztikai kiteket, amelyeket sikerrel alkalmaznak magyarországi élelmiszervizsgáló laboratóriumokban is. Ezek a molekuláris biológiai tesztek főleg olyan mikrobák kimutatására alkalmasak, amelyek jelenléte nagy közegészségügyi kockázatot jelent (például Escherichia coli, Salmonella Typhimurium, Listeria spp.). Kisebb figyelem irányul azokra a kórokozókra, amelyek vizsgálatát jogszabály nem teszi kötelezővé. Ilyen mikróbák például a nyers és pasztőrözött tejben előforduló Serratia fajok is.

A Serratia fajok a környezetünkben sokfelé megtalálhatók [1]. Szaprofiták, illetve opportunista patogének [2]. Fakultatív anaerob, biofilmképző élőlények [1, 3]. A S. marcescens különösen jól szaporodik foszfortartalmú környezetben (például szappanok, samponok), és ellenáll egyes fertőtlenítőszereknek is [4, 5], így különböző nozokomiális betegségek okozója lehet [6, 7, 8]. A szakirodalom beszámol a S. marcescens fokozódó antibiotikum-rezisztenciájáról is [8, 9, 10]. A baktérium tehát könnyen túlél, szaporodik, így nem megfelelő higiénés körülmények között az élelmiszerekbe kerülhet. A fogyasztói tejbe is feltehetően a higiéniai szabályok áthágása következtében juthat, ott elszaporodik és többek között az élelmiszer minőségét is rontja [1, 11, 12]. A romlást némely faj esetén jellegzetes piros színárnyalat jelezi.

A magyarországi tejágazat esetében nem állnak rendelkezésre pontos adatok arról, hogy milyen mértékű a Serratia fajok, illetve a S. marcescens elterjedtsége, és hogy mely fajok okozzák a fertőzéseket, valamint rontják a tej minőségét. Arra vonatkozóan sincs hazai felmérés, hogy milyen mértékű a tejüzemek Serratia-szennyezettsége. Néhány publikációt leszámítva nemzetközi szinten is szegényesek a rendelkezésre álló információk a tejipar Serratia érintettségéről. Ilyen kivétel egy, a finn tejtermelő gazdaságokban tapasztalt, S. marcescens okozta tőgygyulladás-járványt bemutató tudományos cikk [1], valamint egy régebbi beszámoló, amely pigmentképző Serratia fajok masztitiszben játszott szerepét tárgyalja [13].

A tej piros elszíneződéséért a következő Serratia fajok lehetnek felelősek: S. marcescens, S. rubidaea, S. plymuthica és S. nematodiphila (1. táblázat). Előfordulási gyakoriságuk szerint a S. marcescens-nek van nagyobb jelentősége. Jellegzetes pigmentjük a vörös prodigiozin, amely vízben nem oldódó másodlagos anyagcseretermék, és amely meghatározott környezeti körülmények között termelődik [14, 15, 16, 17] (1. ábra). A táptalajon megjelenő tipikus piros telepek önmagukban még nem hordoznak elegendő információt a Serratia azonosításához, ugyanis számos egyéb, nem az enterobaktériumok közé tartozó nemzetség egyes fajai szintén termelhetnek prodigiozint [14, 18].

1. táblázat. Serratia fajok és pigmenttermelésük jellemzése [19–22]
1. ábra. Serratia marcescens tisztatenyészete tripton-szója agaron (TSA) (30 °C, 48 óra)

A Serratia fajok élelmiszerekből történő kimutatására ISO szabvány jelenleg nem áll rendelkezésre. Grimont és Grimont 2006-ban megjelent könyvfejezetében [9] foglalkozik a Serratia nemzetség jellemzőivel, az izolálás és az azonosítás szempontjaival is. A klasszikus mikrobiológiai módszerekkel történő azonosítás azonban meglehetősen körülményes, és a kísérőflóra gátló hatása miatt gyakran eredménytelen is, annak ellenére, hogy a tejminta rózsaszínes elszíneződése szemmel látható. A baktérium szelektív tenyésztésére elérhetők ugyan táptalajok [47], a gyakorlatban viszont ezek használata nem nyújt kielégítő megoldást. A hagyományos eljárások ráadásul idő- és munkaigényesek.

S. marcescens meghatározására létezik kereskedelmi forgalomban lévő gyorsmódszer, például a bioMérieux cég Rapid ID 32 E elnevezésű miniatürizált tesztkészlete, amely megfelel az ISO 7218 szabvány előírásainak [48]. A vizsgálat kivitelezéséhez azonban táptalajon felnövő telep szükséges. A kimutatás nehézségeinek kiküszöbölésére a már korábban említett, PCR módszeren alapuló diagnosztikai tesztek nyújthatnának megoldást. Jelenleg azonban egyedül a Primerdesign cég Genesig fantázianevű terméke említhető S. marcescens kimutatására alkalmas molekuláris diagnosztikai egységcsomagként [49].

Az élelmiszeripari és azon belül a tejipari vonatkozású szakirodalom meglehetősen szegényes a Serratia fajok és köztük S. marcescens végpont PCR vagy real-time PCR módszerrel történő kimutatásának témakörében. Hejazi és munkatársai [50] S. marcescens szerotipizálását végezték el RAPD-PCR technikával. Vizsgálataikhoz kórházi ellátásra szoruló páciensek szerológiai mintáit használták. Iwaya és munkatársai [6] szintén vérmintákat teszteltek S. marcescens törzsekre, real-time PCR módszert alkalmazva. Zhu és munkatársai [51] S. marcescens törzsek molekuláris jellemzését RFLP és PCR módszerrel végezték, míg Joyner és munkatársai [2] real-time PCR vizsgálattal detektáltak S. marcescens törzseket tengeri és egyéb vízi környezeti mintákból (például korall nyák, szivacs pórusvíz, üledék, csatornavíz, szennyvíz és hígított szennyvíz). Bussalleu és Althouse 2018-ben megjelent tanulmánya S. marcescens azonosítására alkalmas, hagyományos végpont PCR-technikáról számol be, amely hatékonyan detektálja a mikroorganizmus jelenlétét vaddisznó spermájában [52].

Célul tűztük ki S. marcescens tejből történő kimutatására alkalmas klasszikus PCR módszer beállítását. Munkánk jelentősége abban áll, hogy a szakirodalomban leírt, PCR vizsgálaton alapuló módszereket és alkalmazott primereket elemeztük, majd a megfelelőnek ítélt eljárást átültettük az élelmiszer-higiéniai vizsgálati gyakorlatba. Kísérleteinkben üzemi, nyers és pasztőrözött tejminták elszíneződésének a hátterében álló esetleges S. marcescens szennyeződés kvalitatív meghatározását végeztük.

3. Anyagok és módszerek

3.1. In silico vizsgálatok

Szakirodalmi közlések alapján kiválasztottunk három primerpárt (2. táblázat), amelyeket számítógépes modellezéssel, ún. in silico analízis során, valamint in vitro kísérletekben értékeltünk abból a célból, hogy a későbbi PCR vizsgálatok megvalósításához megtaláljuk a legalkalmasabbat.

2. táblázat. Alkalmazott Serratia marcescens-specifikus primerpárok

In silico vizsgálatainkban a primer szekvenciák specifikusságát DNS-adatbázissal (NCBI BLAST) [54] történő összehasonlítás útján ellenőriztük. Az adatbázissal történő összevetés a homológia-keresést („blasztolás”) teszi lehetővé. Ezt követően a primerek megfelelőségét, azaz választott genomokon egy lehetséges PCR reakció megvalósulását, molekuláris biológiai szoftverrel (SnapGene 5.1.5.) teszteltük [55]. Az utóbbi esetben az NCBI adatbázisából letöltöttünk pozitív és negatív kontroll genomokat, majd a SnapGene szoftver alkalmazásával vizsgáltuk, hogy in silico módon a primerpárokkal megvalósulhat-e PCR reakció. A referenciának használt pozitív és negatív kontrollok teljes kromoszóma genomok voltak (3. táblázat).

3. táblázat. In silico elemzésben pozitív és negatív kontrollként alkalmazott baktériumtörzsek genomjai, valamint a primerpárokra adott reakcióik

* Primerek: A. Fpfs1 és Rpfs2; B. FluxS1 és RluxS2; C. Serratia2-for és Serratia2-rev.

Jelmagyarázat:

3.2. In vitro kísérletes vizsgálatok

Az in silico vizsgálatok megerősítéseként in vitro kísérleteket végeztünk, amelyek során a kiválasztott primerpárokat laboratóriumi PCR vizsgálatban teszteltük baktériumok (pozitív kontroll törzsként több S. marcescens, negatív kontroll törzsként pedig Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii, Streptococcus thermophilus, Enterococcus faecalis és Micrococcus luteus) választott törzseinek genomi DNS mintáján. A mikroorganizmusok az MTKI Kft. gyűjteményébe tartozó, üzemi környezetből származó, genetikai azonosítással meghatározott baktériumtörzsek voltak.

A PCR reakcióhoz szükséges komponensek összemérése során egy reakcióra 5,2 µL PCR tisztaságú steril vizet, 10 µL DreamTaq Green 2× PCR Master Mixet (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, Egyesült Államok), 0,4–0,4 µL (10 pmol/µl) primert és 4 µL izolált bakteriális genomi DNS-t használtunk. A reakciók negatív kontrollja PCR tisztaságú steril víz volt. A PCR berendezés (Mastercycler Nexus Gradient; Eppendorf International, Hamburg, Németország) programjának paraméterei a következőképpen alakultak: 95 °C 1 perc, majd 40 cikluson keresztül 95 °C 15 másodperc, 59,5 °C 15 másodperc, 72 °C 10 másodperc, végül 72 °C 7 perc [52].

A PCR reakció során képződött DNS szakaszok méret szerinti elválasztáshoz 10 µL mintát vizsgáltunk 2%-os agaróz gélben [TBE puffer (Tris-borate-EDTA) (10×), Thermo Fisher Scientific; Agarose DNA Pure Grade, VWR International, Debrecen, Magyarország; ECO Safe Nucleic Acid Staining Soluion 20.000×, Pacific Image Electronics, Torrance, Kalifornia, Egyesült Államok]. A DNS méretmarker a GeneRuler Low Range DNA Ladder (Thermo Fisher Scientific) volt. A géldokumentálás a Gel Doc Universal Hood II géldokumentációs berendezés és program (Bio-Rad, Hercules, Kalifornia, Egyesült Államok) alkalmazásával történt.

3.3. Nyers és pasztőrözött tejminták vizsgálata

Vizsgálatainkban egyrészt olyan, üzemi nyers és pasztőrözött tejmintákat alkalmaztunk, amelyek kapcsán felmerült a S. marcescens szennyeződés gyanúja azok rózsaszínes elszíneződése miatt. Másrészt teszteltünk az előbbiekkel együtt a laboratóriumba érkezett, elszíneződést azonban nem mutató, szintén üzemi nyers és pasztőrözött tejmintákat is.

A DNS-feltáró és -tisztító folyamathoz NucleoSpin Microbial DNA kitet (Macherey-Nagel, Düren, Németország) alkalmaztunk a gyártói előírások szerint. Az eluált DNS-t tartalmazó reakciócsöveket fagyasztóban tároltuk, -20 °C-on.

A következőkben 16S rDNS polimeráz láncreakcióval kontrolláltuk a DNS izolálás megfelelőségét és a minták amplifikálhatóságát, melyhez a 27f (5’-AGAGTTGATCMTGGCTCAG-3’) és 1492r (5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’) primert alkalmaztuk. A PCR reakció összemérési térfogata 1 mintára: 5,6 µL PCR tisztaságú steril víz, 10 µL DreamTaq Green 2× PCR Master Mix, 0,2–0,2 µL (10 pmol/µl) primerek és 4 µL izolált bakteriális genomi DNS. A reakció negatív kontrollja PCR minőségű steril víz volt. A PCR berendezés programjának paraméterei a következők voltak: 95 °C 4 perc, majd 40 cikluson keresztül 95 °C 20 másodperc, 54 °C 30 másodperc, 72 °C 1 perc, végül 72 °C 5 perc.

A PCR reakció során képződött DNS szakaszok elválasztáshoz 5 µL mintát vizsgáltunk 1%-os agaróz gélben. DNS méretmarker a GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder (Thermo Fisher Scientific) volt. A vizsgált DNS mintát további PCR vizsgálatra alkalmasnak értékeltük, amennyiben az amplifikált DNS fragment kópiáinak hossza a várt méret (~1500 bp) szerint alakult.

Következő lépésben a minták S. marcescens-specifikus PCR vizsgálata és a gélelektroforézis történt a 3.2. In vitro kísérletes vizsgálatok című alfejezetben ismertetett módon. Az eredményeket jelenlét-hiány elv alapján értékeltük.

A módszer megfelelőségének ellenőrzése céljából kontrollvizsgálatban tejminták PCR eredményeit hasonlítottuk össze a néhány esetben meglévő API (bioMérieux, Budapest, Magyarország) vizsgálat eredményeivel. A módszert ezt követően alkalmaztuk S. marcescens jelenlétének nyers és pasztőrözött tejekből történő kimutatására.

4. Eredmények

In silico vizsgálatainkban a primerek homológia vizsgálata során azok elsősorban S. marcescens kromoszóma genomokkal mutattak hasonlóságot. Találtunk azonban egyezést S. rubidaea és S. nematodiphila törzseknél és néhány nem Serratia fajnál is. Az eredményeket figyelembe vettük a SnapGene szoftveres vizsgálatainkhoz tervezett referencia genomok kiválasztásánál. További vizsgálat szükségességét indokolta, hogy a megfelelő homológia, a bázisok illeszkedése még nem jelenti automatikusan egy PCR reakció megvalósulását, mert például a primerek iránya, olvadási hőmérséklete és a képződő PCR termék mérete is meghatározó.

A SnapGene vizsgálatban PCR reakciókat a következő paraméterek mellett prediktáltunk: elemzéseinket legalább 15 bázis egyezése és eltérés (ún. single isolated mismatch) kizárása mellett végeztük. Az olvadási hőmérséklet (melting temperature) legkisebb értéke 50 °C, az amplifikáció eredményeképpen keletkezett fragmentum maximális hossza pedig 3 kbp volt.

Ahogy a 3. táblázatban látható, a Serratia2-for és Serratia2-rev primerpár S. marcescens genomokra illesztve minden esetben mutatott amplifikációt. A PCR reakció általában hat-hét amplikont is eredményezett a 16S rDNS szakaszokon. Az Fpfs1–Rpfs2 és a FluxS1–RluxS2 primerpárok tapadási helye a 16S rDNS-en kívül található a legtöbb S. marcescens törzsben, viszont néhány esetben nem mutattak in silico amplifikációt, érzékenységük tehát nem bizonyult megfelelőnek. A negatív kontroll genomoknál a Serratia2-for és Serratia2-rev primerpár néhány esetben PCR reakció lezajlását jelzi előre bizonyos S. rubidaea és S. nematodiphila törzseknél. Az Fpfs1–Rpfs2 primerek alkalmazásával a PCR reakció egy S. nematodiphila törzs esetén játszódna le. A FluxS1–RluxS2 primerek nem jelezték előre reakció lezajlását egyik választott negatív kontroll genomon sem (3. táblázat).

Az in vitro kísérletekben a pozitív kontrollnak választott S. marcescens genomokon mindhárom primerpár adott jelet a várt fragmentméret szerint, és egyik sem adott jelet a negatív kontrollokon. A Serratia2-for és Serratia2-rev primerpárral végzett vizsgálatot mutatja be a 2. ábra. A negatív mintáknál az 50 bp magasságban megjelenő gyenge jeleket a melléktermékként keletkező aspecifikus DNS darabok, a primer-dimerek felszaporodása okozza.

Az in silico analízisek és az in vitro vizsgálatok eredményei alapján további munkánkhoz a Serratia2-for és Serratia2-rev primereket ítéltük megfelelőnek, annak ellenére, hogy azok specifikussága nem tökéletes. A döntés alapja egyrészt a S. marcescens előfordulásának valószínűsíthető gyakorisága, másrészt a fals negatív vizsgálati eredmények elkerülésének a fontossága volt.

A beállított módszer megfelelőségét ellenőrizendő, kontroll vizsgálatban üzemi tejmintákat teszteltünk. A tejminták (n=10) közül néhány rózsaszínes elszíneződést mutatott. Vizsgálati módszerünkkel kilenc mintát pozitívnak ítéltünk a keresett mikrobára. A minták közül négy esetében API vizsgálati eredménnyel is rendelkeztünk. A négy API-pozitív minta a PCR vizsgálatban is pozitívnak bizonyult. A módszert ezt követően alkalmaztuk S. marcescens nyers és pasztőrözött tejekből történő kimutatására.

A tejminták egy része barackos-rózsaszínes elszíneződést mutatott (3. ábra), ez azonban számos esetben nem volt egyértelmű, a halvány vagy sárgásba hajló színárnyalat miatt. Összesen 60 minta vizsgálatát végeztük el. Ebből 32 db (53,3%) pozitív és 28 db (46,7%) negatív eredményt adott S. marcescens jelenlétére.

A 4. ábrán egyik vizsgálatunk eredményét, a gélelektroforézissel végzett elválasztás képét mutatjuk be. Jól látható, hogy a pozitív kontroll törzs pozitív, a negatív kontroll minta negatív jelet adott, mindemellett három vizsgálati minta esetében pozitív jelet kaptunk. A negatív mintáknál megjelenő gyenge jeleket ebben az esetben is a primer-dimerek felszaporodása okozta.

2. ábra. Serratia2-for és Serratia2-rev primerpárral végzett PCR vizsgálat eredménye választott baktériumtörzsek genomján. Sorok: 1. Serratia marcescens 551R; 2. Serratia marcescens 1911; 3. Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii 0801; 4. Streptococcus thermophilus 1102; 5. Enterococcus faecalis 1101; 6. Micrococcus luteus CLTB1; 7. Negatív kontroll (steril víz); M: Molekulasúly marker
3. ábra. Tejminták. Baloldali minta: Serratia marcescens-negatív, jobboldali minta: Serratia marcescens-pozitív a PCR vizsgálat eredménye alapján
4. ábra. Serratia marcescens-specifikus PCR vizsgálat gélelektroforézis képe. 1.–7.: Tejminták; K+: Pozitív kontroll (Serratia marcescens genomi DNS); K-: Negatív kontroll (steril víz); M: Molekulasúly marker

5. Megbeszélés

Eredményeink értékelésekor fontos figyelembe venni, hogy a PCR vizsgálat a mintában található cél DNS amplifikálására, detektálására alkalmas módszer, amelynek alapján nem lehet megállapítani, hogy az amplifikált S. marcescens-specifikus DNS vajon szaporodóképes, elpusztult, vagy ún. VBNC állapotú sejtekből származik-e. VBNC („viable but not culturable”) állapotban a sejtek életképesek, metabolikusan aktívak, viszont klasszikus, tenyésztéses módszerekkel nem szaporíthatók fel. Az állapot reverzibilis.

Munkánk célja S. marcescens kimutatását szolgáló klasszikus PCR módszer beállítása volt. Az alkalmazott vizsgálati eljárással elvégezhető a tejminták elszíneződésének hátterében álló S. marcescens szennyeződés kvalitatív meghatározása.

Noha itt bemutatott kísérleteinkben a pigmenttermelő S. marcescens kimutatására összpontosítottunk, egy jövőbeli, nemzetség-szintű vizsgálat során mind a 20 Serratia faj (1. táblázat) azonosítása megvalósulhatna. A többi Serratia faj detektálásának jelentőségét az adja, hogy jóllehet a Pseudomonas nemzetség a hűtött nyerstej romlásának legfőbb okozója, ismeretesek a Serratia fajok e tekintetben kimutatható veszélyei is [56]. Pseudomonas törzsekkel együtt ugyanis számos esetben Serratia törzseket is azonosítottak a tej romlásának okozóiként. A Serratia nemzetség tagjait kimutatták tejfeldolgozó üzemekben [3, 12], 4 °C-on tárolt nyerstej-mintákban [56, 57, 58] és tejtartályokban is [59]. Grimont és Grimont [9] már másfél évtizeddel ezelőtt megállapította, hogy a nyerstej-tételek esetenként Serratia fajokkal szennyeződhetnek, a tejtermékekben megjelenő leggyakoribb fajok pedig a S. liquefaciens és a S. grimesii.

A pszichrotróf Serratia fajok (például a S. liquefaciens) nyerstejben való előfordulása a hőkezelés után is minőségroimlást okozhat. Baglinière és munkatársai úgy találták, hogy a S. liquefaciens által termelt hőstabil Ser2 proteáz az UHT tej destabilizációjának jelentős tényezője lehet [11, 60].

Következtetésképpen megállapítható, hogy érdekes és hiánypótló kutatás lenne egy nemzetség-szintű vizsgálat, amelynek révén lehetőség nyílna a nyerstejek ilyen szempontú monitorozására, a Serratia fajok széleskörű detektálására. Az eredmények vélhetően nemcsak a tejgazdaság, tejipar szereplői számára nyújtanának hasznos információkat, hanem a hazai szabályozási és ellenőrzési gyakorlatra is hatással lehetnének.

6. Irodalom

[1] Friman, M.J., Eklund, M.H., Pitkälä, A.H., Rajala-Schultz, P.J., Rantala, M.H.J. (2019): Description of two Serratia marcescens associated mastitis outbreaks in Finnish dairy farms and a review of literature. Acta Veterinaria Scandinavica. 61, pp. 54. https://doi.org/10.1186/s13028-019-0488-7

[2] Joyner, J., Wanless, D., Sinigalliano, C.D., Lipp, E.K. (2014): Use of quantitative real-time PCR for direct detection of Serratia marcescens in marine and other aquatic environments. Applied and Environmental Microbiology. 80, pp. 1679-1683. https://doi.org/10.1128/AEM.02755-13

[3] Cleto, S., Matos, S., Kluskens, L., Vieira, M.J. (2012): Characterization of contaminants from a sanitized milk processing plant. PLoS ONE. 7(6), e40189. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0040189

[4] Langsrud, S., Møretrø, T., Sundheim, G. (2003): Characterization of Serratia marcescens surviving in disinfecting footbaths. Journal of Applied Microbiology. 95, pp. 186-195. https://doi.org/10.1046/j.1365-2672.2003.01968.x

[5] Møretrø, T., Langsrud, S. (2017): Residential bacteria on surfaces in the food industry and their implications for food safety and quality. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. 16, pp. 1022-1041. https://doi.org/10.1111/1541-4337.12283

[6] Iwaya, A., Nakagawa, S., Iwakura, N., Taneike, I., Kurihara, M., Kuwano, T., Gondaira, F., Endo, M., Hatakeyama, K., Yamamoto, T. (2005): Rapid and quantitative detection of blood Serratia marcescens by a real-time PCR assay: Its clinical application and evaluation in a mouse infection model. FEMS Microbiology Letters. 248, pp. 163-170. https://doi.org/10.1016/j.femsle.2005.05.041

[7] Bayramoglu, G., Buruk, K., Dinc, U., Mutlu, M., Yilmaz, G., Aslan, Y. (2011): Investigation of an outbreak of Serratia marcescens in a neonatal intensive care unit. Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 44, pp. 111-115. https://doi.org/10.1016/j.jmii.2010.02.002

[8] Moradigaravand, D., Boinett, C.J., Martin, V., Peacock, S.J., Parkhill, J. (2016): Recent independent emergence of multiple multidrug-resistant Serratia marcescens clones within the United Kingdom and Ireland. Genome Research. 26, pp. 1101-1109. https://doi.org/10.1101/gr.205245.116

[9] Grimont, F., Grimont, P.A.D. (2006): The genus Serratia. Prokaryotes. 6, pp. 219-244. https://doi.org/10.1007/0-387-30746-X_11

[10] Sandner-Miranda, L., Vinuesa, P., Cravioto, A., Morales-Espinosa, R. (2018): The genomic basis of intrinsic and acquired antibiotic resistance in the genus Serratia. Frontiers in Microbiology. 9, pp. 828. https://doi.org/10.3389/fmicb.2018.00828

[11] Baglinière, F., Tanguy, G., Salgado, R.L., Jardin, J., Rousseau, F., Robert, B., Harel-Oger, M., Dantas Vanetti, M.C., Gaucheron, F. (2017): Ser2 from Serratia liquefaciens L53: A new heat stable protease able to destabilize UHT milk during its storage. Food Chemistry. 229, pp. 104-110. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2017.02.054

[12] Salgado, C.A., Baglinière, F., Vanetti, M.C.D. (2020): Spoilage potential of a heat-stable lipase produced by Serratia liquefaciens isolated from cold raw milk. LWT - Food Science and Technology. 126, 109289. https://doi.org/10.1016/j.lwt.2020.109289

[13] Barnum, D.A., Thackeray, E.L., Fish, N.A. (1958): An outbreak of mastitis caused by Serratia marcescens. Canadian Journal of Comparative and Medical Veterinary Science. 22, pp. 392-395.

[14] Malik, K., Tokkas, J., Goyal, S. (2012): Microbial pigments: A review. International Journal of Microbial Resource Technology. 1 (4), pp. 361-365.

[15] Petersen, L.M., Tisa, L.S. (2013): Friend or foe? A review of the mechanisms that drive Serratia towards diverse lifestyles. Canadian Journal of Microbiology. 59, pp. 627-640. https://doi.org/10.1139/cjm-2013-0343

[16] Darshan, N., Manonmani, H.K. (2015): Prodigiosin and its potential applications. Journal of Food Science and Technology. 52, pp. 5393-5407. https://doi.org/10.1007/s13197-015-1740-4

[17] Srimathi, R., Priya, R., Nirmala, M., Malarvizhi, A. (2017): Isolation, identification, optimization of prodigiosin pigment produced by Serratia marcescens and its applications. International Journal of Latest Engineering and Management Research. 2 (9), pp. 11-21.

[18] Giri, A.V., Anandkumar, N., Muthukumaran, G., Pennathur, G. (2004): A novel medium for the enhanced cell growth and production of prodigiosin from Serratia marcescens isolated from soil. BMC Microbiology. 4, pp. 11. https://doi.org/10.1186/1471-2180-4-11

[19] Mahlen, S.D. (2011): Serratia infections: From military experiments to current practice. Clinical Microbiology Reviews. 24, pp. 755-791. https://doi.org/10.1128/CMR.00017-11

[20] Analyzer of Bio-resource Citations (2020): Microorganism Search for Paper, Patent, Genome and Nucleotic. http://abc.wfcc.info/index.jsp. Hozzáférés 2020.04.21.

[21] Birla Institute of Scientific Research, Bioinformatics Centre (2015): Database of Biochemical Tests of Pathogenic Enterobacteriaceae Family. https://bioinfo.bisr.res.in/cgi-bin/project/docter/serratia.cgi. Hozzáférés 2020.04.21.

[22] LPSN (2020): List of Prokaryotic Names with Standing in Nomenclature. https://lpsn.dsmz.de/genus/serratia. Hozzáférés 2020.04.21.

[23] Kämpfer, P., Glaeser, S.P. (2016): Serratia aquatilis sp. nov., isolated from drinking water systems. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 66, pp. 407-413. https://doi.org/10.1099/ijsem.0.000731

[24] Grimont, P.A.D., Jackson, T.A., Ageron, E., Noonan, M.J. (1988): Serratia entomophila sp. nov. associated with amber disease in the New Zealand grass grub Costelytra zealandica. International Journal of Systematic Bacteriology. 38, pp. 1-6. https://doi.org/10.1099/00207713-38-1-1

[25] Grimont, P.A.D., Grimont, F., Starr, M.P. (1979): Serratia ficaria sp. nov., a bacterial species associated with Smyrna figs and the fig wasp Blastophaga psenes. Current Microbiology. 2, pp. 277-282. https://doi.org/10.1007/BF02602859

[26] Anahory, T., Darbas, H., Ongaro, O., Jean-Pierre, H., Mion, P. (1998): Serratia ficaria: A misidentified or unidentified rare cause of human infections in fig tree culture zones. Journal of Clinical Microbiology. 36, pp. 3266-3272. https://doi.org/10.1128/JCM.36.11.3266-3272.1998

[27] Gavini, F., Ferragut, C., Izard, D., Trinel, P.A., Leclerc, H., Lefebvre, B., Mossel, D.A.A. (1979): Serratia fonticola, a new species from water. International Journal of Systematic Bacteriology. 29, pp. 92-101. https://doi.org/10.1099/00207713-29-2-92

[28] Grimont, P.A.D., Grimont, F., Irino, K. (1982): Biochemical characterization of Serratia liquefaciens sensu stricto, Serratia proteamaculans, and Serratia grimesii sp. nov.. Current Microbiology. 7, pp. 69-74. https://doi.org/10.1007/BF01568416

[29] Hennessy, R.C., Dichmann, S.I., Martens, H.J., Zervas, A., Stougaard, P. (2020): Serratia inhibens sp. nov., a new antifungal species isolated from potato (Solanum tuberosum). International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 70, pp. 4204-4211. https://doi.org/10.1099/ijsem.0.004270

[30] Bizio, B. (1823): Lettera di Bartolomeo Bizio al chiarissimo canonico Angelo Bellani sopra il fenomeno della polenta porporina. Biblioteca Italiana, o sia Giornale di Letteratura, Scienze, e Arti (Anno VIII). 30, pp. 275-295.

[31] Williams, R.P., Gott, C.L., Qadri, S.M.H., Scott, R.H. (1971): Influence of temperature of incubation and type of growth medium on pigmentation in Serratia marcescens. Journal of Bacteriology. 106, pp. 438-443. https://doi.org/10.1128/JB.106.2.438-443.1971

[32] Wang, J., Zheng, M.L., Jiao, J.Y., Wang, W.J., Li, S., Xiao, M., Chen, C., Qu, P.H., Li, W.J. (2019): Serratia microhaemolytica sp. nov., isolated from an artificial lake in Southern China. Antonie Van Leeuwenhoek. 112, pp. 1447-1456. https://doi.org/10.1007/s10482-019-01273-9

[33] García-Fraile, P., Chudíčková, M., Benada, O., Pikula, J., Kolařík, M. (2015): Serratia myotis sp. nov. and Serratia vespertilionis sp. nov., isolated from bats hibernating in caves. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 65, pp. 90-94. https://doi.org/10.1099/ijs.0.066407-0

[34] Zhang, C.X., Yang, S.Y., Xu, M.X., Sun, J., Liu, H., Liu, J.R., Liu, H., Kan, F., Sun, J., Lai, R., Zhang, K.Y. (2009): Serratia nematodiphila sp. nov., associated symbiotically with the entomopathogenic nematode Heterorhabditidoides chongmingensis (Rhabditida: Rhabditidae). International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 59, pp. 1603-1608. https://doi.org/10.1099/ijs.0.003871-0

[35] Grimont, P.A.D., Grimont, F., Richard, C., Davis, B.R., Steigerwalt, A.G., Brenner, D.J. (1978): Deoxyribonucleic acid relatedness between Serratia plymuthica and other Serratia species, with a description of Serratia odorifera sp. nov. (type strain: ICPB 3995). International Journal of Systematic Bacteriology. 28, pp. 453-463. https://doi.org/10.1099/00207713-28-4-453

[36] Van Houdt, R., Moons, P., Jansen, A., Vanoirbeek, K., Michiels, C.W. (2005): Genotypic and phenotypic characterization of a biofilm-forming Serratia plymuthica isolate from a raw vegetable processing line. FEMS Microbiology Letters. 246, pp. 265-272. https://doi.org/10.1016/j.femsle.2005.04.016

[37] Zhang, C.W., Zhang, J., Zhao, J.J., Zhao, X., Zhao, D.F., Yin, H.Q., Zhang, X.X. (2017): Serratia oryzae sp. nov., isolated from rice stems. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 67, pp. 2928-2933. https://doi.org/10.1099/ijsem.0.002049

[38] Lehman, K.B., Neumann, R. (1896): Atlas und Grundriss der Bakeriologie und Lehrbuch der Speziellen Bakteriologischen Diagnostik, Volume 11st Ed. J.F. Lehmann, München.

[39] Breed, R.S., Murray, E.G.D., Hitchens, A.P. (Eds.) (1948): Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 6th ed. Williams and Wilkins Co., Baltimore, MD, USA. pp. 1-1529.

[40] Paine, S.G., Stansfield, H. (1919): Studies in bacteriosis. III. A bacterial leaf spot disease of Peotea cynaroides, exhibiting a host reaction of possibly bacteriolytic nature. Annals of Applied Biology. 6, pp. 27-39. https://doi.org/10.1111/j.1744-7348.1919.tb05299.x

[41] Grimont, P.A.D., Grimont, F., Starr, M.P. (1978): Serratia proteamaculans (Paine and Stansfield) comb. nov., a senior subjective synonym of Serratia liquefaciens (Grimes and Hennerty) Bascomb et al. International Journal of Systematic Bacteriology. 28, pp. 503-510. https://doi.org/10.1099/00207713-28-4-503

[42] Ashelford, K.E., Fry, J.C., Bailey, M.J., Day, M.J. (2002): Characterization of Serratia isolates from soil, ecological implications and transfer of Serratia proteamaculans subsp. quinovora Grimont et al. 1982 to Serratia quinovorans corrig., sp. nov.. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 52, pp. 2281-2289. https://doi.org/10.1099/00207713-52-6-2281

[43] Stapp, C. (1940): Bacterium rubidaeum nov. spec. Zentralblatt für Bakteriologie, Parasitenkunde, Infektionskrankheiten und Hygiene, Abt. II. 102, pp. 252-260.

[44] Ewing, W.H., Davis, B.R., Fife, M.A., Lessel, E.F. (1973): Biochemical characterization of Serratia liquefaciens (Grimes and Hennerty) Bascomb et al. (formerly Enterobacter liquefaciens) and Serratia rubidaea (Stapp) comb. nov. and designation of type and neotype strains. International Journal of Systematic Bacteriology. 23, pp. 217-225. https://doi.org/10.1099/00207713-23-3-217

[45] Sabri, A., Leroy, P., Haubruge, E., Hance, T., Frère, I., Destain, J., Thonart, P. (2011): Isolation, pure culture and characterization of Serratia symbiotica sp. nov., the R-type of secondary endosymbiont of the black bean aphid Aphis fabae. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 61, pp. 2081-2088. https://doi.org/10.1099/ijs.0.024133-0

[46] Bhadra, B., Roy, P., Chakraborty, R. (2005): Serratia ureilytica sp. nov., a novel urea-utilizing species. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 55, pp. 2155-2158. https://doi.org/10.1099/ijs.0.63674-0

[47] Starr, M.P., Grimont, P.A.D., Grimont, F., Starr, P.B. (1976): Caprylate-thallous agar medium for selectively isolating Serratia and its utility in the clinical laboratory. Journal of Clinical Microbiology. 4, pp. 270-276.

[48] BioMérieux (2015): API & ID 32 Identification Databases. https://www.biomerieux-diagnostics.com/sites/clinic/files/9308960-002-gb-b-apiweb-booklet.pdf. Hozzáférés 2020.04.02.

[49] Primerdesign (2019): Serratia marcescens Genesig kit. https://www.genesig.com/products/9405-serratia-marcescens. Hozzáférés 2020.04.02.

[50] Hejazi, A., Keane, C.T., Falkiner, F.R. (1997): The use of RAPD-PCR as a typing method for Serratia marcescens. Journal of Medical Microbiology. 46, pp. 913-919. https://doi.org/10.1099/00222615-46-11-913

[51] Zhu, H., Zhou, W.Y., Xu, M., Shen, Y.L., Wei, D.Z. (2007): Molecular characterization of Serratia marcescens strains by RFLP and sequencing of PCR-amplified 16S rDNA and 16S-23S rDNA intergenic spacer. Letters in Applied Microbiology. 45. pp. 174-178. https://doi.org/10.1111/j.1472-765X.2007.02166.x

[52] Bussalleu, E., Althouse, G.C. (2018): A PCR detection method for discerning Serratia marcescens in extended boar semen. Journal of Microbiological Methods. 151, pp. 106-110. https://doi.org/10.1016/j.mimet.2018.06.012

[53] Zhu, H., Sun, S.J., Dang, H.Y. (2008): PCR detection of Serratia spp. using primers targeting pfs and luxS genes involved in AI-2-dependent quorum sensing. Current Microbiology. 57, pp. 326-330. https://doi.org/10.1007/s00284-008-9197-6

[54] National Center for Biotechnology Information (2020): Search database. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/. Hozzáférés 2020.03.20.

[55] Insightful Science (2020): SnapGene Software. https://www.snapgene.com/. Hozzáférés 2020.03.20.

[56] Machado, S.G., Baglinière, F., Marchand, S., Van Coillie, E., Vanetti, M.C.D., De Block, J., Heyndrick, M. (2017): The biodiversity of the microbiota producing heat-resistant enzymes responsible for spoilage in processed bovine milk and dairy products. Frontiers in Microbiology. 8, p. 302. https://doi.org/10.3389/fmicb.2017.00302

[57] Lafarge, V., Ogier, J.C., Girard, V., Maladen, V., Leveau, J.Y., Gruss, A., Delacroix-Buchet, A. (2004): Raw cow milk bacterial population shifts attributable to refrigeration. Applied and Environmental Microbiology. 70, pp. 5644-5650. https://doi.org/10.1128/AEM.70.9.5644-5650.2004

[58] Ribeiro Jr., J.C., de Oliveira, A.M., de G. Silva, F., Tamanini, R., de Oliveira, A.L.M., Beloti, V. (2018): The main spoilage-related psychrotrophic bacteria in refrigerated raw milk. Journal of Dairy Science. 101, pp. 75-83. https://doi.org/10.3168/jds.2017-13069

[59] Decimo, M., Morandi, S., Silvetti, T., Brasca, M. (2014): Characterization of gram-negative psychrotrophic bacteria isolated from Italian bulk tank milk. Journal of Food Science. 79, pp. 81-90. https://doi.org/10.1111/1750-3841.12645

[60] Baglinière, F., Salgado, R.L., Salgado, C.A., Dantas Vanetti, M.C. (2017): Biochemical characterization of an extracellular heat-stable protease from Serratia liquefaciens isolated from raw milk. Journal of Food Science. 82, pp. 952-959. https://doi.org/10.1111/1750-3841.13660

Tovább a cikk olvasásához


Legfrissebb szám



Támogató és együttműködő partnereink

TÉMAKERESÉS