angol-magyar
kétnyelvű tudományos folyóirat
HUN / ENG

Mikrobiológia


Gyümölcsjoghurtok eltarthatóságának vizsgálata az ízesítőanyagok kezeléseinek függvényében

Cikk letöltése PDF formátumban

Gyümölcsjoghurtok eltarthatóságának vizsgálata az ízesítőanyagok kezeléseinek függvényében

DOI: https://doi.org/10.52091/EVIK-2021/1-3-HUN

Érkezett: 2020. szeptember – Elfogadva: 2020. december

Szerzők

1 Széchenyi István Egyetem Mezőgazdaság- és Élelmiszertudományi Kar, Élelmiszertudományi Tanszék, Mosonmagyaróvár

Kulcsszavak

joghurtkészítés, mikrohullámú besugárzás, gyümölcsaszalás, mikrobiológiai paraméterek, összcsíraszám, élesztőszám, penészszám, Escherichia coli, coliform

1. Összefoglalás

A tej és a tejtermékek az emberiség táplálkozásának egyik alapját képezik értékes összetevőik és kellemes érzékszervi tulajdonságaik miatt. Kutatásaink célja volt azt vizsgálni, hogy a különböző hőkezelési eljárások (mikrohullámú sugárzás, aszalás), hogyan befolyásolják a tejtermékek (joghurt) eltarthatóságát mikrobiológiai vonatkozásban. Méréseink során a termékek előállításánál felhasznált ízesítőanyagok (alma, banán) eltérő hőkezelési paramétereinek hatását vizsgáltuk a termékek mikrobiológiai tulajdonságaira és ezáltal annak eltarthatóságára nézve. Kísérleteink során az adalékanyagok kezelési formáiként a hagyományos aszalásos (55 °C, 24 óra) és a mikrohullámú sugárzásos technológiát (800 W, 55 °C, 10 perc) alkalmaztunk. Összehasonlításokat végeztünk mikrobiológiai paraméterek tekintetében (összcsíra-szám, élesztő/penész-szám és E. coli/coliform-szám). Eredményeink alapján úgy véljük, hogy az aszalásos eljárás abban az esetben biztosíthat mikrobiológiai biztonságot élelmiszer előállítása során, ha a berendezésben keringő levegő megfelelő higiéniai tulajdonságokkal bír. A mikrohullámú sugárzási technológia az élelmiszerek – jelen esetben gyümölcsök - esetében sikeresen alkalmazható mikrobák gátlására. Ugyanaz a kezelési paraméter azonban nem alkalmazható különböző gyümölcsök esetén.

2. Bevezetés és szakirodalmi áttekintés

A tej az emberiség táplálkozásának egyik alapját képezi az emberiség történelmének kezdetétől fogva. Hasznos összetevői kedvező hatást gyakorolnak az ember egészséges testi és szellemi fejlődésére. A tej alkotórészei élettani szempontból előnyösek, ezek közül is magas kálcium tartalma kiemelkedő, ennél fogva a fejlődő szervezet csontképzésében játszik szerepet [1], valamint a szervezet számára fontos és jól hasznosítható fehérjéket is tartalmaz. Mindezen tulajdonságai révén a tejtermékek az emberi táplálkozás alapélelmiszereinek tekinthetők. Az élelmiszeriparban számos haszonállat tejét feldolgozzák (juh, kecske, szarvasmarha), de Magyarországon legnagyobb mennyiségben a tehéntejet fogyasztják.

A joghurt olyan tejipari termék, amelyet az egész világon fogyasztanak. A táplálkozástudománnyal foglalkozó szakemberek úgy vélik, hogy ez a savanyú tejkészítmény magas táplálkozási értékkel (laktóztartalmának jelentős része elbomlik a fermentáció során és jelentős Ca++ koncentrációval rendelkezik) és előnyös bioaktív hatásokkal (prebiotikus összetevők és probiotikus baktériumok) bír. A natúr joghurtot olyan tejsavbaktériumok hozzáadásával állítják elő, amelyeknek alapvető élettani tevékenységük során a táptalajban tejsavas erjedés zajlik. Az összes, tejből előállított termék közül a joghurt a legnépszerűbb világszerte. [2].

Gyümölcsjoghurt esetében, ha szárított gyümölcsöket vagy szárított darabokat adnak a joghurthoz, a szárítmányok hajlamosak felszívni a joghurtgél szabad vízének egy részét, és ezáltal segítik a termék savójának elválasztását a tárolás során [3]. A gyümölcs adagolásának az is előnye, hogy egyes kutatások [4] szerint 10 v/v%-nyi gyümölcs adalékanyag hozzáadása szignifikánsan javítja a termék fizikai-kémiai tulajdonságait. Az egészséges növényi szövetek belseje nem tartalmaz mikroorganizmusokat, így a növényi nyersanyagok elsődleges mikrobiotája főként a talajból, a vízből, a levegőből esetenként rovaroktól vagy állatoktól származik. A talajban (gumók, gyökerek) és a talaj közelében fejlődő növényi részek általában erősen szennyezettek, mikroflórájuk összetétele gyakorlatilag megegyezik a talajéval. A gyümölcsök felületén körülbelül 103-105 CFU/g nagyságrendben találni mikroorganizmusokat, amelyek egy jelentős részét a tejsav- és az ecetsavbaktériumok teszik ki. A mikrobiota legnagyobb részét azonban az élesztőgombák alkotják, amelyek közül a leggyakoribbak a Hensaniaspora, Torulaspora, Pichia, Saccharomyces, Candida és a Rhodotorula fajok. Gyakori romlást okozó mikroorganizmusok a gyümölcsöknél az Alternaria, Aspergillus, Fusarium, Monilia és a Mucor fajok. A gyümölcsök a penészgombák kiváló táptalajai, melyek között sok mikotoxin termelő is van. A nyersanyag szennyezettsége és a helytelen tárolási körülmények gyakran lehetővé teszik mérgező anyagcseretermékek képződését is. Penészes gyümölcsökből (elsősorban almából és körtéből) mutatható ki például a patulin az Aspergillus és Penicillum gombák által termelt méreganyag (mikotoxin) [5].

A gyümölcsök technológiai feldolgozása során a darabolás, szeletelés, aprítás, hámozás növeli annak valószínűségét, hogy más anyagokról, eszközökről és felszerelésekről származó keresztszennyezés következik be a gyártás és a feldolgozás különböző szakaszaiban. Ezenkívül a cukrok és más tápanyagok megnövekedett elérhetősége a minimálisan feldolgozott gyümölcsökben hozzájárul a mikrobiota változásához és növeli annak populációját [6, 7]. A nyersanyag mikrobiotájának fő tényezői a gyártás során felhasznált anyagok és a feldolgozó berendezések felületének higiéniája, a gyártási környezet és az élelmiszer-kezelők higiéniája, amelyek meghatározzák a végtermék mikrobiológiai minőségét és biztonságát. [8, 9, 10]. Egy, a minimálisan feldolgozott növényi élelmiszerekkel kapcsolatos tanulmány szerzői nagy összes aerob mikroorganizmus-számot mutattak ki az élelmiszerekkel érintkező felületeken, különösen a hámozóberendezéseken, késeken és a vágódeszkákon [10]. Ugyanezen kutatók számoltak be arról is, hogy a vágóasztalokon és a vágódeszkákon magas az Enterobacteriaceae család fakultatív anaerob baktériumainak száma [10]. Bár minden feldolgozóüzem gyártási folyamatai között alkalmaznak mosási és egyéb szennyeződés-mentesítési eljárásokat, mégis nehéz elérni a mikrobiális szennyeződések nagymértékű csökkentését. [11]. A csomagolás és a tárolás időszakában is kialakulhatnak kedvező feltételek a gyümölcsökben és zöldségekben előforduló mikroorganizmusok szaporodásához. Lehto és munkatársai vizsgálataik során aerob mikroorganizmusok nagy számát fedezték fel zöldségfeldolgozó üzemek felületi mintavételei során a már tisztított zöldségekkel érintkező eszközökön és berendezéseken, valamint a tároló-, feldolgozó- és csomagoló helyiségek légterében [10].

Az élelmiszeriparban a hőkezelési eljárások az élelmiszerbiztonság legfontosabb meghatározói. A tej hőkezelése azért van szükség, hogy annak mikrobiológia biztonsága garantálható legyen a tejben lévő patogén mikroorganizmusok elpusztítása révén. Az élelmiszeriparban többféle hőkezelési módszert alkalmaznak. A hőkezelés hatékonyságát szigorúan meghatározott hőmérséklet és hőntartási idő biztosítja. A termékek alapanyagain kívül fontos szerepet tölt be az adalékanyagok megfelelő mikrobiológiai tulajdonságainak biztosítása is. „A hőkezelés a tej, a tejszín stb. melegítésével, hevítésével kapcsolatos művelet, amelynek célja a mikroorganizmusok számának csökkentése, elpusztítása” [12]. A hőkezelés a tejfeldolgozás során általános technológiai lépés, amelynek célja a tej eltarthatóságának javítása a mikroorganizmusok és enzimek inaktiválásával. A kedvező mikrobiológiai állapotú alapanyag használata javíthatja egyes tejtermékek, például a joghurt textúrájának minőségét [13] is.

A mikrohullámú technikát, mint hőkezelési eljárást, elsősorban a háztartásokban használják. Az élelmiszeriparban jelenleg csak egyes területeken tudják megbízhatóan alkalmazni. Ennek oka, hogy a mikrohullámú berendezésekben a hőátadás nem egyenletes, a termékben alul- vagy túlmelegített helyek alakulnak ki. Csőben áramoltatott folyadékoknál – pl. tej mikrohullámú energiával történő kezelése esetén – ez elkerülhető [5]. Ahol használható ez a technika, ott előnyt jelent, mivel az élelmiszereknél alkalmazott kezelések ideje lecsökkenthető, így a technológia gazdaságossá tehető. A költséghatékonyság mellett további előny, hogy a hő- és anyagtranszport iránya azonos, így nem alakul ki az áramlást gátló száraz kéreg [14]. Alkalmazási területei: szárítás, mélyhűtött hús kiolvasztása, temperálás, pasztőrözés, sterilizálás és az élelmiszerek elszíneződésének megakadályozására [15, 16].

A mikrohullámú sugárzásnak sterilizáló és mikrobapusztító hatást is tulajdonítanak. Pozar kísérletei során [17] ezt a hatást 2450 MHz, néhány esetben pedig már 915 MHz frekvencia alkalmazása mellett tudta biztosítani. A sugárzás azáltal növeli az élelmiszerek minőségmegőrzési idejét, hogy az élelmiszerekben található mikrobákat elpusztítja és/vagy szaporodásukat gátolja.

Mikrohullámú sugárzás mikrobákra kifejtett hatását sokféle élelmiszerben, élelmiszer alapanyagban, főleg húsfélékben vizsgálták. A mikrohullámú pasztőrözés [18] elterjedését segítette, hogy alkalmazásával az élelmiszereknél nagymértékű károsodással nem kell számolni, szemben a hagyományos hőközlési eljárásokkal. Ennek oka a rövid hőkezelési és besugárzási idő [19, 20].

A mikrohullámú kezelési technológia mellett hagyományosabb eljárásnak minősül az aszalás, amelynek lényege az, hogy a gyümölcsből – esetenként zöldségből – kíméletes hőközléssel kivonják a víztartalom nagyrészét, ezt követően visszamarad egy intenzív ízű koncentrátum, a kiindulási anyagnál lényegesen kisebb tömegben és méretben. Így az aszalványon maradó mikroszkopikus élőlények a hozzáférhető víz hiánya miatt elvesztik élet- és szaporodó képességüket. A friss gyümölcsök 90-95% vizet tartalmaznak, amely az aszalás után 15% alá csökken. Ilyen módon baktériumok és penészek által előidézett romlás megelőzhető, miközben bizonyos tápanyagok, ballasztanyagok és ásványi anyagok megmaradnak, közülük például a vas. Az aszalt gyümölcsök a friss gyümölcsökhöz képest sok szénhidrátot, rostot és antioxidánsokat, flavonoidokat, fenolsavakat, karotinoidokat és vitaminokat tartalmaznak koncentrált formában [21, 22].

Az élelmiszeripar változatos összetételű joghurt-készítményt állít elő, de a gyártásuk során alkalmazott technológiai műveletek a tej beoltásáig közel azonosak. A tejet általában 2-3%-os starterkultúrával oltják be és 40-45 °C-on inkubálják. Ebben a hőmérsékleti tartományban a kívánt végső savtartalmat 3-4 óra alatt állítják be. Alacsonyabb hőmérséklet (30-37 °C) alkalmazása esetén a művelet hosszabb ideig tart (7-8 óra) ebben az esetben viszont megakadályozható a termék túlzott savasodása [23].

A joghurt ízéért, illatáért és textúrájáért elsősorban a Streptococcus thermophilus baktérium a felelős, és valójában önmagában is képes a pasztőrözött tejet joghurttá erjeszteni, ennek ellenére a fermentációhoz a Streptococcus mellett a Lactobacillus bulgaricus-t is alkalmazzák a termékben keletkező savak előállítása érdekében. A S. thermophilust és az L. bulgaricust általában 1:1 arányban egyszerre oltják be a tejbe (pH 6,6). Arányuk az erjedés előre haladtával megváltozik [24].

3. Anyag és módszer

A termékek gyártása

A termékek gyártásához nyers, hőkezelés nélküli, valamint 2,8 %-os zsírtartalmú UHT fogyasztói tejet (Mizo) használtunk fel, amelyet 2:1 arányban elegyítettünk a joghurtok készítése előtt. A nyerstejet 75 °C-on 15 percig főzőlapon pasztőröztük a megfelelő kezdeti mikrobiológiai biztonság elérése érdekében, majd hozzáadagoltuk a fogyasztói tejet. A hőkezelés után megvártuk, amíg a tej hőmérséklete 30 °C-ra csökken, majd beoltottuk a felhasználási útmutató szerinti mennyiségű (YF-L812, Chr. Hansen, Franciaország) termofil joghurtkultúrával (Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus és Streptococcus thermophilus) és 15 percig kevertük a megfelelő homogenitás biztosítása érdekében. A beoltott tejet 2 dl-es műanyag joghurtos poharakba adagoltuk és 43 °C-os termosztátba (Binder, Németország) helyeztük, ahol 7 órán át alvasztottuk őket (pH 4,6). A savas alvadás után a joghurtokba kevertük az alábbi eljárásokkal kezelt gyümölcsöket.

Kísérletünk során a kontrollminta kivételével kétféle hőkezelési eljárást alkalmaztunk a gyümölcsök esetében, mikrohullámú hőkezelést és hagyományos hőkezelési eljárást (aszalás).

A kísérlet során beállított minták:

  • 1. minta: gyümölcsös joghurt - nyers alma hozzáadásával (Ny-A)
  • 2. minta: gyümölcsös joghurt - nyers banán hozzáadásával (Ny-B)
  • 3. minta: gyümölcsös joghurt - aszalt alma hozzáadásával (A-A)
  • 4. minta: gyümölcsös joghurt - aszalt banán hozzáadásával (A-B)
  • 5. minta: gyümölcsös joghurt - mikrohullámmal hőkezelt alma hozzáadásával (MH-A)
  • 6. minta: gyümölcsös joghurt - mikrohullámmal hőkezelt banán hozzáadásával (MH-B)

A nyers gyümölcsöket tiszta, nyomódástól és hibás részektől mentes, kifogástalan állapotban, optimális érettségi fokban dolgoztuk fel.

A mikrohullámú kezeléshez a MARS 5 (CEM Corporation, USA) mikrohullámú roncsoló berendezést használtunk. A felkockázott nyers almát és banánt a mikrohullámú berendezés mintatartójába helyeztük, majd mikrohullámú kezelésnek vetettük alá. A készüléken az energiaközlési programot úgy állítottuk be, hogy 800 W teljesítménnyel 100%-os hatásfokkal 10 perces hőntartási idővel, a gyümölcsök 55 °C-ra melegedjenek fel, összesen 15 perc alatt. A hőmérséklet detektálását és kontrollálását a mintatartóba vezetett szenzor (RTP 300) segítségével végezte el a berendezés.

Az aszalási folyamatban felhasznált gyümölcsöket egyenlő méretű cikkekre (0,5 cm) vágtuk, hogy azonos idő alatt száradjanak, majd ezután 55 °C-on 24 órán át aszalóberendezésbe helyeztük. Az aszalt, illetve mikrohullámmal hőkezelt gyümölcsöket ezután ledaráltuk. A használat előtt a késeket és a darálóberendezést Mikrozid fertőtlenítővel kezeltük. A ledarált gyümölcsökből 5-5 grammot adagoltunk 150 ml, már elkészült joghurtmintákhoz. A további vizsgálatokig a joghurt-gyümölcs-aszalvány keverékeket hűtőszekrényben 4 °C hőmérsékleten tároltuk.

3.2. A termékek eltarthatósági vizsgálatai

A termékeket 4 héten át vizsgáltuk eltarthatóság szempontjából. A vizsgálatokat a 0., 7., 14., 21. és 28. napon végeztük el. A mikrobiológiai tulajdonságok (összcsíraszám, élesztő/penész-szám, E. coli/coliform-szám) vizsgálatára a gyártástól számítva heti rendszerességgel került sor. A kísérletet minden mintavételi napon 3 párhuzamos méréssel végeztük el (n=3), tehát mintánként (Ny-A; Ny-B, A-A; A-B; MH-A; MH-B) 15 mintával, így a mérések során összesen 90 mintával dolgoztunk.

A mikroorganizmusok tenyésztéséhez lemezöntéses eljárást alkalmaztunk. Élelmiszer-biztonsági és technológiai higiéniai szempontból a 105/cm3 összcsíraszám jelenti nyerstej esetében a kritikus határt, mert a normál pasztőrözési eljárások ennél a mikrobaszámnál még kellő hatékonysággal alkalmazhatók.

Az összes mikrobaszám meghatározását PC (Plate Count, Biolab) táptalajon végeztük el, 30±1 °C-on 72 órás inkubációs idővel [25]. Az MSZ ISO 7954:1999 szabványban rögzített szelektív táptalajon, 25 °C-on való tenyésztéssel az élesztő- és penészgombák telepeket képeznek. A kimutatásukra a szabvány által meghatározott YGC agart (Yeast Extract Glucose Chloramphenicol Agar, Biolab) használtunk. Ez a szelektív táptalaj tejből és tejtermékekből az élesztők és fonalasgombák izolálására és számolására alkalmas. A lemezeket 48 órán át 25±1 °C-on inkubáltuk, ezután a kifejlődött telepeket a lemezeken megszámoltuk [26].

A coliform-szám és az E. coli-szám együttes meghatározását CC agar (ChromoCULT Coliform Agar, Biolab) alkalmazásával lehet megoldani. A telepek elkülönítését segíti, hogy a coliform telepek színe lazac- piros, az E. coli telepek pedig sötétkéktől az ibolyáig változtatják színüket. Az inkubációs paraméterek E. coli/coliform esetében 24 óra 35-37 °C [27].

Mérési eredményeinket Microsoft Office Excel 2016® program segítségével ábrázoltuk. A mikrobiológiai eredmények kiértékelése során a mikrobaszámokat logaritmizált formában jelenítettük meg: az egyes pontokra illesztett egyenesek meredekségi értékei a mikroorganizmusok exponenciális szaporodási fázisát jellemzik.

4. Eredmények és értékelés

4.1. Az almás joghurt minták vizsgálati eredményei

4.1.1. Összcsíraszám

Az 1. ábrán tanúsága szerint a mérés 0., 7. és 14. napján is az összcsíraszám az aszalt almás joghurt és a mikrohullámmal kezelt almás joghurt esetében közel azonos eredményeket mutat. A nyers almás joghurt már a 2. mérés (7. nap) alkalmával magasabb összcsíraszám-értéket értékeket mutatott a másik két mintához képest. Itt már szignifikáns eltérést tapasztalunk a sejtszámok között, amely eltérés az idő elteltével csak növekedett (14. nap). A mikrohullámmal kezelt almával és az aszalt almával kiegészített joghurt esetében a sejtszámok növekedésének tendenciája hozzávetőlegesen azonos mértéket mutatott. Ezt az eredményt az 1. ábrán megjelölt meredekség-értékek is alátámasztják.

1. ábra. Az összcsíraszám meghatározásának eredményei az almás joghurtok esetében

4.1.2. Élesztő/Penész-szám

A 2. ábra alapján megállapítható, hogy az első mérési adattól kezdve az utolsó mérési eredményig a mikrohullámmal kezelt és az aszalt almás joghurt szignifikánsan alacsonyabb élesztőszámot mutat, mint nyers almás joghurt értékei. A MH-A és A-A minták között nem alakult ki ilyen nagyságrendű különbség, azonban a mérés 21. napján már itt is egyértelmű, szignifikáns különbség mutatkozott a MH-A javára. Ezek alapján a mikrohullámmal végzett hőkezelés bizonyult hatásosabbnak az élesztőgombák élettevékenységének gátlásához az általunk alkalmazott kezelési beállítások mellett.

Az almával kiegészített joghurtok esetében egyértelműen megállapítható, hogy az összcsíraszám, az élesztő- és penészszám esetén egyaránt a mikrohullámú technológia mutatkozott a legjobb kezelési eljárásnak. Ehhez hasonló sejtszámokat és szaporodási tendenciákat eredményezett az aszalt gyümölcs adalékot tartalmazó joghurt. A tárolási idő elteltével azonban itt már a sejtszámok között nagyobb különbségek alakultak ki. Eltarthatóság szempontjából a legrosszabb eredényeket a nyers nyümölcsös minták esetében kaptuk. Nagyságrendnyi különbségeket mértünk a másik két mintához képest, szignifikáns elétrések voltak tapasztalhatók (p≤0,05).

2. ábra. Az élesztőgombaszám meghatározás eredményei az almás joghurtok esetében

A 21. napon, a harmadik mintavételi időpontban a mikrohullámmal kezelt almás joghurtokat leszámítva, a nyers, és az aszalt almás joghurtok megromlottak. A harmadik mérés után a nyers, valamint az aszalt almás joghurtokban a magas élesztőgombaszám mellett jelentős számú penészgomba jelent meg. A mikrohullámmal kezelt almás joghurtokon ezzel szemben a harmadik mérést követően sem voltak kimutatható penészgombatelepek.

Penészgombaszámra vonatkozóan a hatályos rendelet [27] alapján a fermentált tej, tejtermék, savanyított tejtermék, túró, túrókészítmények esetén a megfelelőség szint (m) 102 CFU/cm3 a visszautasítás határértéke (M) 5*103 CFU/cm3.

Penészgombák tekintetében az almás joghurtok esetében az első két mérés alkalmával, a 0. és 7. napon nem mutattuk ki a penészgombák jelenlétét. A kísérlet 14. napján a nyers gyümölcsös és az aszalt almás mintánál megjelentek a penészgombák telepei, nyers alma estében már a rendelet által meghatározott visszautasítási szint feletti értékkel (3*104 CFU/cm3). Az aszalt almás termék esetében azonban a vonatkozó előírások szerint [27] még elfogadható szinten (2,2*102 CFU/cm3) marad penészgomba-telepek száma.

4.2. A banános joghurt vizsgálati ereményei

4.2.1. Összcsíraszám

A banános joghurtok esetében megállapítottuk, hogy a kétféle kezelési eljárás (aszalás, mikrohullám) szintén hatással van a mikrobaszám alakulására. A mikrohullámmal kezelt minta esetén a mikrobaszám emelkedése a kísérlet 21. napjáig nem mutatott intenzív növekedést a kezdeti sejtszámhoz képest (3. ábra). Ezzel ellentétben a nyers és aszalt gyümölccsel kiegészített joghurtok esetében az összcsíraszám hétről-hétre emelkedett. Mindezek mellett azt is megállapítottuk, hogy az aszalt gyümölccsel kiegészített minta sejtszáma a legmagasabb, és ennél a mintánál tapasztaltuk a sejtszám legintenzívebb növekedését is. A tárolási kísérlet 7. napján már szignifikáns különbségek alakultak ki a minták vizsgálati eredményei között, ezek közül is az A-B minta tér el nagyságrendileg a Ny-B és MH-B mintáktól. A mérés 14. napján már mindhárom minta adata között nagyságrendnyi eltéréseket tapasztaltunk. Összcsíraszám tekintetében a MH-B minta esetében volt legalacsonyabb a sejtszám növekedés.

3. ábra. Az összcsíraszám meghatározás eredményei a banános joghurtok esetében

4.2.2. Élesztő/penész szám

Az élesztőszám eredményei (4. ábra) alapján megállapítottuk, hogy a nyers- és mikrohullámmal kezelt banános joghurtok esetében nincs számottevő különbség a minták telepszámainak, illetve a mikroorganizmusok szaporodási tendenciái tekintetében. Az aszalt almás joghurtok esetében azonban a sejtszám gyors növekedése volt jellemző, ami a termék organoleptikus tulajdonságait is befolyásolta. A mintavétel 7. napjától már szignifikáns különbségek alakultak ki a MH-B és Ny-B valamint a A-B és Ny-B minták között. A leghatékonyabbnak ebben az esetben is a mikrohullámú kezelés bizonyult.

A banános joghurtok esetében is vizsgáltuk a penészszám alakulását az eltarthatósági idő alatt. Az eredmények azt mutatták, hogy az első két mérés alkalmával, a 0. és a 7. napon a penésztelepek nem alakultak ki. A kísérlet 14. napján azonban az aszalt banános mintánál penészgombák jelentek meg 1,4*104 CFU/cm3 mennyiségben, amely jóval meghaladja a rendelet szerinti megfelelőségi határértéket (102 CFU/cm3), sőt már a visszautasítási kategóriába esik (5*103 CFU/cm3). A másik két minta (nyers és mikrohullámmal kezelt banán) esetében a 14. napon penészgombák nem voltak jelen. A kísérlet 21. napján a nyers banánnal kiegészített joghurtban is megjelentek a penészgombák 3,0*101 CFU/cm3 mennyiségben, amely még nem haladja meg a megfelelőségi határértéket. Az MH-B mintánál penészgomba még mindig nem volt kimutatható. A kísérlet 28. napján a penészgombaszám a nyers banános joghurt esetben is hozzávetőlegesen 1 nagyságrenddel meghaladta a visszautasítási határértéket. Az MH-B mintánál penészgomba még a 28. napon sem volt kimutatható.

Az aszalt termékek esetén kapott eredmények arra engednek következtetni, hogy a kíméletes hőkezeléssel végzett 24 órás aszalás nem javította kellő mértékben a felhasznált anyagok mikrobiológiai állapotát. Feltehető, hogy az aszalóberendezésen átáramló levegő higiéniai állapota sem volt megfelelő. Úgy véljük, hogy a joghurt készítményekhez előkészített gyümölcsök aszalását csak olyan helyiségben és berendezésben célszerű végezni, amelynek levegője kifogástalan, valamint elszívó és megfelelő légszűrőrendszerrel rendelkezik.

4.2.3. A joghurtok E. coli/coliform eredményei

Az Escherichia coli baktérium a normál bélflóra legfontosabb mikrobája, így minden melegvérű állat és az ember emésztőrendszerének természetes összetevője. Az élelmiszerekbe gyümölcsökről, zöldségekről kerülhet, ha azokat nem tisztították elég alaposan, de a nyers tejben vagy az abból készült tejtermékekben is előfordulhat.

4. ábra. Az élesztőszám meghatározás eredményei a banános joghurtok esetében

A hatályos rendelet [28] alapján a fermentált tej, tejtermék, savanyított tejtermék, túró, túrókészítmények esetén a megfelelőség szint (m)<1/CFU/cm3 a visszautasítás határértéke (M)<10/CFU/cm3.

A kísérlet 0. és 7. napján elvégzett vizsgálatok alakalmával E. coli baktérium az általunk előállított minta egyikében sem volt kimutatható. A kísérlet 21. napján (3. hét) azonban a nyers banános és mikrohullámmal kezelt banános mintákon kívül az összes joghurtban kimutathatóvá vált a baktérium. A mérés 4. hetére az E. coli a nyers banános joghurtban is megjelent. Így a vizsgálat végére csak a mikrohullámmal kezelt banánnal kiegészített joghurt felelt meg a jogszabályi előírásoknak.

A coliform baktériumok megtalálhatók a vizes élőhelyeken, a talajban és a növényzeten; és általában nagy számban vannak jelen a melegvérű állatok székletében.

A hatályos – 4/1998. (XI. 11.) EüM – rendelet alapján a fermentált tej, tejtermék, savanyított tejtermék, túró, túrókészítmények esetén a megfelelőség szint (m)<10 CFU/cm3 a visszautasítás határértéke (M)<102 CFU/cm3.

A coliform baktériumokat a kísélrlet 0. napján az összes mintában kimutattuk, azonban a nem megfelelőségi határértéket csak az aszalt gyümölccsel kiegészített joghurtok mintáinak eredményei haladták meg. 1 hét elteltével azonban a coliformok csak az aszalt banános joghurt esetében voltak kimutathatók. Valószínűleg a joghurt pH értékének csökkenése akadályozta a baktériumok szaporodást és életben maradását.

A mérés 3. hetében a nyers gyümölccsel kiegészített mintáink esetében észleltünk coliform baktériumokat a többi mintában nem voltak jelen. Esetünkben a nyers gyümölccsel kiegészített minták elérték az M értéket, így 21 nap eltelte után a termékek nem voltak alkalmasak emberi fogyasztásra.

A mikrobiológiai vizsgálatok során a rendelet alapján előírt Salmonella és Staphylococcus aureus meghatározását is elvégeztük. Ezek a vizsgálatok minden esetben negatív eredményt hoztak.

Schnabel és munkatársai hétféle mikrobatörzzsel fertőzött meg (köztük az általunk vizsgaált E. coli baktériummal) nyers gyümölcsöket 108 nagyságrendű sejtszámmal. Ezután mikrohullámmal támogatott plazmával kezelték a mintákat, amelynek hatására a sejtszámot már 5 perces kezelés után 4 nagyságrenddel volt képes csökkenteni. A kezelést non-termális körülmények között (30 °C-on) végezték, kizárva ezzel a hőmérséklet mikrobapusztító hatását [29].

Ez a jelenség munkacsoportunk mérései során abban nyilvánult meg, hogy az E. coli mikrohullámmal kezelt banános joghurtban a mérés 28. napjára sem volt kimutatható, szemben a nyers- és aszalt banános joghurtokkal. Ezzel szemben az almával kevert joghurtokban sajnos a kísérlet végére az E. coli jelenlétét észleltük.

Picouet és munkatársai kimutatták, hogy a mikrohullámú kezelések az E. coli O157: H7 és összcsíraszám értékeket hasonlóképpen befolyásolták, 1,01-1,16 log CFU g-1 csökkenést detektáltak. Ugyanezen kezelési paraméterek nagymértékben befolyásolta az L. innocua-t, a populációk a kimutatási határ alatt voltak (10 CFU g-1) a legtöbb esetben. Alma pürémintákban az összcsíraszám stabil maradt az 5 °C-on történő tárolás során, enyhe növekedéssel a 14. napon [30]. Ez a tendencia saját méréseink során is megfigyelhető volt. Eredményeink igazolják, hogy megvalósítottuk kutatásunk célkitűzését, amely a mikrohullámú kezelés mikrobapusztító és gátló hatásának igazolása volt.

Eredményeinket az is alátámasztja, hogy 5-25 másodperces (65 °C, 1200 W, 2,45 GHz) mikrohullámú kezelés képes zöldségek esetében a Salmonella sejtszámot 4-5 nagyságrenddel csökkenteni, ezzel is igazolható a mikrohullám többi kezeléshez viszonyított erősebb mikrobapusztító hatása [31].

5. Következtetések és javaslatok

A joghurtok ízesítő anyagaként felhasznált gyümölcsök esetében kétféle hőkezelést alkalmaztunk a termékek eltarthatóságának növelése érdekében. A mikrohullámú kezelési eljárás eltarthatóságra kifejtett hatását a hagyományos és kezeletlen gyümölcsök joghurtba való adagolása utáni eltarthatósági idő hosszával jellemeztük.

A mikrobiológia vizsgálatok alapján megállapítottuk, hogy a különböző hőkezelések közül a mikrohullámú kezelés volt a leghatékonyabb. A gyümölcsök hőkezelésének módszerei közül a mikrohullámú besugárzás eredményezett alacsonyabb csíraszámot a kezeletlen és az aszalásos technológiához képest.

A mikrobiológiai eredményeink alapján úgy véljük, hogy a nyers gyümölcs szennyezettsége vagy textúrája alapvetően befolyásolja a kezelés hatékonyságát. A banán mikrohullámú kezelése után a joghurtban kísérleteink végére (28. nap) sem volt kimutatható az E. coli baktérium jelenléte, szemben a kezelt alma esetében, ahol a 14. napon már kimutattuk annak jelenlétét. Ez azért lehet említésre méltó, mert a termék készítésének napján egyik esetben sem észleltük az E. coli jelenlétét. Feltételezhető, hogy a mikrohullámú sugárzás banán puha textúrájába intenzívebben fejtette ki csíraölő hatását, mint a keményebb konzisztenciájú alma esetében.

Megállapítottuk, hogy az aszalásos eljárás abban az esetben alkalmas mikrobiológiailag biztonságos élelmiszer előállítására, ha a berendezésben keringő levegő mikrobiológiai állapota is megfelelő.

Eredményeink alapján feltételezzük, hogy a mikrohullámú besugárzási technológia az élelmiszerek – jelen esetben gyümölcsök – esetében sikeresen alkalmazható az élelmiszerek belsejében, illetve felületén élő mikroorganizmusok gátlására.

Az almával ízesített joghurtok esetén a nyers gyümölcsös minták mikrobiológiai jellemzői voltak rosszabbak, ezekkel szemben a banán esetében az aszalásos technológia bizonyult mikrobiológiai szempontból a legkedvezőtlenebbnek. Ennek valószínű oka az lehet, hogy a banán az almával összehasonlítva átlagosan háromszor nagyobb mennyiségű szénhidrátot tartalmaz, amely az aszalás következtében koncentrálódott. A joghurtba kevert magas szénhidrát tartalmú gyümölcs pedig tápanyagként szolgálhatott a különböző mikroorganizmusok számára.

Annak érdekében, hogy megállapítsuk, hogy a mikrohullámban 55 °C-tól eltérő hőmérséklet, eltérő teljesítmény és kezelési időtartam alkalmazása eltarthatóság szempontjából kedvezőbb eredményeket hozna-e vagy sem, további vizsgálatok elvégzésére van szükség.

A hőkezelési eljárások közül a mikrohullám alkalmas lehet mind a tej kezelésére, így a mikrobaszám csökkentésére, mind pedig az alkalmazott ízesítőanyagok (fűszerek, gyümölcsök, zöldségek) csíraszámának csökkentésére.

6. Köszönetnyilvánítás

A publikáció elkészítését az EFOP-3.6.1-16-2016-00024 azonosítószámú „Intelligens szakosodást szolgáló fejlesztések az Állatorvostudományi Egyetem és a Széchenyi István Egyetem Mezőgazdaság- és Élelmiszertudományi Karának együttműködésében” című projekt támogatta. A projekt az Európai Unió támogatásával, az Európai Szociális Alap társfinanszírozásával valósult meg.

7. Irodalom

[1] Kukovics, S. (2009): A tej szerepe a humán táplálkozásban. Melánia Kiadó, Budapest.

[2] Coïsson, J.D., F. Travaglia, G. Piana, M. Capasso and M. Arlorio, (2005): Euterpe oleracea juice as a functional pigment for yogurt. Food Research International, 38 (8-9) pp. 893-897. https://doi.org/10.1016/j.foodres.2005.03.009

[3] Tamime, A.Y., Robinson. R.K. (1999): Yoghurt, Science and Technology. Cambridge, UK: Woodhead Publishing Limited. https://doi.org/10.1201/9780415876162

[4] Tarakci, Z., Kücüköner, E. (2003): Physical, chemical, microbiological and sensory characteristics of some fruit flavored yoghurt. Yüzüncü Yıl Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dergisi 14 (2) pp. 10-14.

[5] Deák, T. (2006): Élelmiszer mikrobiológia. Mezőgazda Kiadó, Budapest.

[6] Oms-Oliu G., Rojas-Grau M.A., Gonzalez L.A., Varela P., Soliva-Fortuny R., Hernando M.I.H., Munuera I.P., Fiszman S., & Martin-Belloso, O. (2010): Recent approaches using chemical treatments to preserve quality of fresh-cut fruit: A review. Postharvest Biology and Technology 57 (3) pp. 139-148. https://doi.org/10.1016/j.postharvbio.2010.04.001

[7] Pasha, I., Saeed, F., Sultan, M.T., Khan, M. R., & Rohi, M. (2014): Recent developments in minimal processing: A tool to retain nutritional quality of food. Critical Reviews in Food Science and Nutrition 54 (3) pp. 340-351. https://doi.org/10.1080/10408398.2011.585254

[8] Abadias, M., Usall, J., Anguera, M., Solsona, C., & Viñas, I. (2008): Microbiological quality of fresh, minimally-processed fruit and vegetables, and sprouts from retail establishments. International Journal of Food Microbiology, 123 (1-2) pp. 121-129. https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2007.12.013

[9] Johnston, L. M., Jaykus, L. A., Moll, D., Martinez, M. C., Anciso, J., Mora, B., & Moe, C. L. (2005): A field of study of the microbiological quality of fresh produce. Journal of Food Protection 68 (9) pp. 1840-1847. https://doi.org/10.4315/0362-028X-68.9.1840

[10] Lehto, M., Kuisma, R., Maatta, J., Kymalainen, H. R., & Maki, M. (2011). Hygienic level and surface contamination in fresh-cut vegetable production plants. Food Control 22 (3-4) pp. 469-475. https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2010.09.029

[11] Beuchat, L. R. (1998): Progress in conventional methods for detection and enumeration of foodborne yeasts. Food Technology and Biotechnology 36 (4) pp. 267-272.

[12] Magyar Élelmiszerkönyv (Codex Alimentarius Hungaricus): 2-51 számú irányelv, Tej és tejtermékek, Dairy products

[13] Vasbinder, A. J.; C. G. De Kruif. (2003): Casein-whey protein interactions in heated milk: the influence of pH. International Dairy Journal 13 (8) pp. 669-677. https://doi.org/10.1016/S0958-6946(03)00120-1

[14] Berecz, L. (1999): Élelmiszerek száradási jellemzői, különös tekintettel az élesztőkre, PhD disszertáció, Pannon Agrártudományi Egyetem, Mezőgazdaságtudományi Kar, Mosonmagyaróvár

[15] Tang, Z. W., Mikhaylenko, G., Liu, F., Mah, J.H., Pandit, R., Younce, F., Tang, J.M., (2008): Microwave sterilization of sliced beef in gravy in 7-oz trays. Journal of Food Engineering 89 (4) pp. 375-383. https://doi.org/10.1016/j.jfoodeng.2008.04.025

[16] Venkatesh, M.S., Raghavan, G.S.V., (2004): An overview of microwave processing and dielectric properties of agri-food materials. Biosystems Engineering 88 (1) pp. 1-18. https://doi.org/10.1016/j.biosystemseng.2004.01.007

[17] Pozar, M.D. (1993): Microwave Engineering, Addison-Wesley Publishing Company.

[18] Rosenberg, U., Bogl, W. (1987): Microwave pasteurization, sterilization, blanching, and pest control in the food industry. Food Technology 41 (6) pp. 92-99.

[19] Lau, M.H., Tang, J. (2002): Pasteurization of pickled asparagus using 915 MHz microwaves. Journal of Food Engineering 51 (4) pp. 283-290. https://doi.org/10.1016/S0260-8774(01)00069-3

[20] Wang, Y., Wig, T.D., Tang, J., Hallberg, L.M. (2003): Dielectric properties of foods relevant to RF and microwave pasteurization and sterilization. Journal of Food Engineering 57 (3) pp. 257-268 https://doi.org/10.1016/S0260-8774(02)00306-0

[21] Bennett, L.E., Jegasothy, H., Konczak, I., Frank, D., Sudharmarajan, S., Clingeleffer, P.R. (2011): Total polyphenolics and anti-oxidant properties of selected dried fruits and relationships to drying conditions. Journal of Functional Foods 3 (2) pp. 115-124. https://doi.org/10.1016/j.jff.2011.03.005

[22] Donno, D., Beccaro, G.L., Mellano, M.G., Cerutti, A.K., & Bounous G. (2015): Goji berry fruit (Lycium spp.): antioxidant compound fingerprint and bioactivity evaluation. Journal of Functional Foods 18 (B) pp. 1070-1085. https://doi.org/10.1016/j.jff.2014.05.020

[23] Hassan, A.N., Ipsen, R., Janzen, T., Qvist, K.B., (2003): Microstructure and rheology of yogurt made with cultures differing only in their ability to produce exopolysaccharides. Journal of Dairy Science 86 (5) pp. 1632-1638. https://doi.org/10.3168/jds.S0022-0302(03)73748-5

[24] Huang, L., Lu, Z., Yuan, Y., Lu, F., Bie, X., (2006): Optimization of a protective medium for enhancing the viability of freeze-dried Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus based on response surface methodology. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology 33 (1) pp. 55-61. https://doi.org/10.1007/s10295-005-0041-8

[25] Magyar Szabványügyi Testület (MSzT) (2014): Az élelmiszerlánc mikrobiológiája. Horizontális módszer a mikroorganizmusok számlálására. 1. rész: Telepszámlálás 30 °C-on lemezöntéses módszerrel Magyar Szabvány MSZ EN ISO 4833-1:2014. Magyar Szabványügyi Testület, Budapest.

[26] Magyar Szabványügyi Testület (MSzT) (1999): Mikrobiológia. Általános útmutató élesztők és penészek számlálásához. Telepszámlálási technika 25 °C-on. Magyar Szabvány MSZ ISO 7954:1999. Magyar Szabványügyi Testület, Budapest.

[27] Magyar Szabványügyi Testület (MSzT) (2014): Az Escherichia coli és coliform baktériumok megszámlálása. 2. rész: A legvalószínűbb szám módszere (EN ISO 9308-2:2014). Angol Szabvány MSZ EN ISO 9308-2:2014. Magyar Szabványügyi Testület, Budapest.

[28] 4/1998. (XI. 11.) EüM rendelet: Az élelmiszerekben előforduló mikrobiológiai szennyeződések megengedhető mértékéről (hatályos: 2020. 04. 02.)

[29] Schnabel, U., Niquet , R., Schlüter, O., Gniffke, H.; Ehlbeck, J. (2014): Decontamination and sensory properties of microbiologically contaminated fresh fruits and vegetables by microwave plasma processed air (PPA). Journal of Food Processing and Preservation 29 (6) pp. 1745-4549. https://doi.org/10.1111/jfpp.12273

[30] Picouet, P. A., Landl, A., Abadias, M., Castellari, M., Viñas, I. (2009): Minimal processing of a Granny Smith apple purée by microwave heating, Innovative Food Science and Emerging Technologies 10 (2009) pp. 545-550. https://doi.org/10.1016/j.ifset.2009.05.007

[31] Vega, M., López, S., Malo, L., Morales, S. (2012): Inactivation of Salmonella typhimurium in fresh vegetables using water-assisted microwave heating. Food Control 26 (1) pp. 19-22. https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2012.01.002

Tovább a cikk olvasásához


Élelmiszerekből izolált staphylococcus fajok antibiotikum rezisztencia vizsgálata

Cikk letöltése PDF formátumban

Élelmiszerekből izolált staphylococcus fajok antibiotikum rezisztencia vizsgálata

DOI: https://doi.org/10.52091/EVIK-2021/2-1-HUN

Érkezett: 2021. február – Elfogadva: 2021. április

Szerzők

a Debreceni Egyetem, Mezőgazdaság-, Élelmiszertudományi és Környezetgazdálkodási Kar, Élelmiszertudományi Intézet
b BIOMI Kft.
c Pázmány Péter Katolikus Egyetem
d WESSLING Hungary Kft.
e Állatorvostudományi Egyetem
* Levelező szerző: horvath.brigitta920108@gmail.com

Kulcsszavak

élelmiszer, Staphylococcus, antibiotikum rezisztencia, MALDI-TOF-MS, baktérium identifikálás, élelmiszerbiztonság, humán patogén, nozokómiás fertőzés

1. Összefoglalás

A methicillin-rezisztens Staphylococcus aureus (MRSA) törzsek élelmiszerláncban előforduló jelenlétét számos tanulmány igazolta az Európai Unióban, azonban Magyarországon kevés adat áll rendelkezésünkre ezzel kapcsolatban. Jelen vizsgálat célja az élelmiszerekből izolált Staphylococcus törzsek antibiotikum rezisztenciá-jának vizsgálata klasszikus mikrobiológiai, molekuláris biológiai módszerekkel és MALDI-TOF-MS technikával, továbbá az antibiotikum rezisztens törzsek multilókusz szekvencia tipizálása (MLST). A vizsgálat során 47 koaguláz-pozitív (CPS) és 30 koaguláz-negatív Staphylococcus (CNS) izolátumot gyűjtöttünk. A MALDI-TOF-MS vizsgálat során minden CPS izolátum (n=47) S. aureus fajnak bizonyult, míg a CNS törzsek esetében 8 különböző fajt azonosítottunk. Két S. aureus törzs esetében állapítottunk meg methicillin-rezisztenciát, amelyek közül az egyik izolátum eddig még nem ismert szekvencia típusba, míg a másik MRSA törzs az ST398 típusba tartozott, amely a mezőgazdasági haszonállatokból izolált MRSA törzsek leggyakoribb típusa az EU/EGT területén.

(Az „MRSA” rövidítést köznapi szóhasználatban, de esetenként a szakirodalomban is gyakran a „multirezisztens Staphylococcus aureus” megjelölésére használják. A szerzők kéziratában - helyesen a methicillin-rezisztens kórokozót jelölik így. A Szerk.)

2. Bevezetés és irodalmi áttekintés

Az antibiotikum rezisztens mikroorganizmusok által okozott nozokómiális infekciók (kórházhigiénés fertőzések – a szerk.) száma minden országban növekedést mutat, ezáltal egyre nagyobb kihívás elé állítva az egészségügyi ellátórendszert [1, 2]. A helyzetet tovább súlyosbítja az a tény, hogy az antibiotikum rezisztens Staphylococcus fajok már nem csak a közösségekben és az egészségügyben, hanem az intenzív állattartásban, ezáltal az élelmiszerláncban is megjelentek [3].

A Staphylococcus fajokban az antibiotikum rezisztenciával és virulenciával kapcsolatos gének a mobilis genetikai elemekben (MGE) találhatók, mint például a kromószóma kazettákban, patogenitási szigeteken, plazmidokban vagy transzpozonokban [4]. A methicillinnel szembeni rezisztenciáért a mecA gén felelős: a gén egy módosított penicillin-kötő fehérjét kódol, amely csökkenti a legtöbb béta-laktám antibiotikum, így a penicillin és a methicillin kötődési affinitását. A mecA gén a Staphylococcus kromószóma kazettán (SSCmec) található, amely egy MGE csoport és csak a Staphylococcus fajokban található meg [5]. A mecA gén Staphylococcus fajok közötti átvitelének mechanizmusa nem ismert, azonban bizonyítékok támasztják alá a horizontális géntranszfert a koaguláz-pozitív és koaguláz-negatív Staphylococcus fajok között [6].

A methicillin-rezisztens Staphylococcus aureus (MRSA) törzsek élelmiszerláncban előforduló jelenlétéről már több tanulmány beszámolt. Szerzőik egy része állati eredetű élelmiszermintákból, másik része pedig nyers húsmintákból (sertés, hal, baromfi) izolált törzsek vizsgálatát végezte el. Hollandiában 2009-ben 2217 különböző élelmiszermintát vizsgáltak meg, amelynek a 12%-a MRSA törzsnek bizonyult [7], míg egy dániai vizsgálat során 153 sertéshúsmintának a 4,6%-a, az importált 173 sertéshúsmintának pedig a 7,5%-a volt fertőzött MRSA törzzsel [8]. Németországban nyers tejből, sertéshúsból, pulykahúsból és brojler csirkehúsból is azonosítottak MRSA törzseket [9]. Magyarországon egy tehenészeti telep 595 egyedi tejmintájából 27 db MRSA izolátumot azonosítottak [10], egy másik vizsgálatban 42 telep 626 S. aureus izolátuma közül csak 4 törzs bizonyult methicillin rezisztensnek [11]. Ezeken túl azonban más élelmiszerkategóriából származó és fogyasztásra kész élelmiszerekből eddig nem vizsgálták az MRSA jelenlétét. A törzsek molekuláris tipizálási eredményei rámutattak arra, hogy az MRSA számos típusa jelen van az élelmiszerláncban a különböző országokban [12], azonban a leggyakrabban a CC398-as típus fordult elő, amely az EU és az EGT területén a mezőgazdasági haszonállatokból izolált MRSA törzsek 85%-át teszi ki [13, 14, 7,15].

A további methicillin-rezisztens Staphylococcus (MRS) fajok előfordulását az élelmiszerekben azonban már kevesebb tanulmány vizsgálta. Nigériában 255 tradicionális ételből származó izolátumból 13 Staphylococcus faj (S. xylosus, S. epidermidis, S. simulans) mutatott methicillin-rezisztenciát [16]. Egy Lengyelországban végzett tanulmány során 58 készételből izolált törzsből 33 Staphylococcus törzs (S. epidermidis, S. simulans, S. xylosus, S. hycus, S. lentus, S. saprophyticus) mutatott rezisztenciát legalább egy fajta antibiotikummal szemben [17].

Az Európai Unióban az élelmiszerekből és haszonállatokból izolált Staphylococcus törzsek antibiotikum rezisztenciájának ellenőrzése jelenleg önkéntes, ezért 2016-ban csak Németország, Svájc, Dánia és Spanyolország jelentett ezzel kapcsolatos információt. Az MRSA előfordulási gyakorisága országonként eltérő volt, ám az összehasonlítás során figyelembe kell venni, hogy a vizsgálatokat eltérő állatfajokból, húsokból és húskészítményekből izolált törzseken végezték el [18]. A humán fertőzések kis hányada vezethető vissza a CC398-as típusú MRSA törzsekre és azok is legfőképp szakmai expozíciókra korlátozódnak, mint az állatgyógyászat és az intenzív állattartás. Ennek ellenére a CC398-as típusú MRSA törzsekben kimutatható virulencia faktorok lehetővé teszik a magas patogenitást, így a folyamatos revízió mind az állatokban, mind az élelmiszerekben elengedhetetlen [19]. A felügyelet szükségességét az egyéb Staphylococcus fajok antibiotikum rezisztenciájának esetleges fennállása is indokolja, amely lehetőséget nyújt a rezisztencia terjedésére, és veszélyt jelent a fogyasztók egészségére.

A sikeres felügyeleti rendszer elengedhetetlen feltétele, hogy egy egységes, gazdasági szempontból is elfogadható, gyors és megbízható módszer álljon rendelkezésre a mikroorganizmusok faji szintű azonosításában és antibiotikum rezisztencia meghatározásában, amelynek ígéretes alappillére lehet a fehérje azonosításon alapuló (peptide mass fingerprint) mátrix-asszisztált lézer deszorpciós, ionizációs, repülési idő mérésén alapuló tömegspektrometria (MALDI-TOF-MS). A 2000-es évek kezdetén számos tanulmány számolt be olyan specifikus fragment ionokról, amelyek lehetővé teszik az antibiotikum rezisztens Staphylococcus törzsek gyors azonosítását. A legtöbbet vizsgált biomarker a 2414 m/z értékű fragment ion volt, amelynek megjelenése a tömegspektrumban az MRSA törzsekre jellemző psm-mec expressziójával korrelál [20]. A detektáláshoz és diszkriminációhoz a 2414 m/z értékű fragment ion alkalmazhatóságát több tanulmány is igazolta [21, 22].

Az MRSA törzsek biomarkereinek vizsgálatain kívül más tanulmányok további Staphylococcus fajok methicillin-rezisztencia specifikus fragment ion csúcsait elemezték. Egy korábbi cikkben két specifikus fragment ion-értéket határoztak meg: a 7239 m/z értékű ion fragment-csúcsot, amely a methicillin-rezisztens S. epidermidis és a 9674 m/z fragment-ion csúcsot, amely a methicillin-rezisztens S. haemolyticus biomarkere [23].

Saját kísérleteink célja az élelmiszerekből izolált Staphylococcus törzsek methicillin rezisztenciájának vizsgálata klasszikus mikrobiológiai, molekuláris biológiai módszerekkel és MALDI-TOF-MS technikával, továbbá az antibiotikum rezisztens törzsek multilókusz szekvencia tipizálása volt (MLST) a törzsek epidemiológiai vizsgálata céljából.

3. Vizsgálati anyag és módszer

3.1. Gyűjtött izolátumok és tenyésztési körülmények

A WESSLING Hungary Kft. Mikrobiológiai laboratóriumában a 2019. augusztus és 2020. szeptember közötti időszakban az MSZ EN ISO 6888-1:2008 szabvány előírásai alapján izolált 77 Staphylococcus izolátumot vizsgáltunk. Az izolátumokat 37 °C-on, 24±1 órán keresztül Baird-Parker (Biokar, Franciaország) szelektív táptalajon tenyésztettük és a Staphylococcusokra jellemző kolóniákat Columbia véres agarra (Neogen, UK) oltottuk át (37 °C, 24±1 óra). A tenyésztés során 47 törzs mutatott pozitív koaguláz reakciót, míg 30 izolátum koaguláz-negatívnak bizonyult, amelyet latex agglutinációs gyorsteszttel (PASTOREX™ STAPH-PLUS) is igazoltunk. Az izolátumokat nyers húsból, húskészítményekből és fogyasztásra készételekből gyűjtöttük: baromfi (n=14), marha (n=5), sertés (n=42), vad (n=1), hal (n=1), tejtermék (n=3), készételek (n=3), zöldségek (n=2) és száraztészta (n=6).

3.2. Izolátumok azonosítása MALDI-TOF-MS technikával

A gyűjtött 77 izolátum azonosítását Bruker Microflex LT MALDI-TOF tömegspektrométerrel és a MALDI BioTyper 3.1 (Bruker Daltonics) szoftverrel végeztük el. Hangyasavas szuszpendálási protokollt alkalmaztunk, amely során Columbia véres agarról egy önálló telepet vettünk fel egy steril kacs segítségével, majd 40 µl hangyasavban szuszpendáltunk el. A szuszpenzióhoz 40 µl acetonitrilt adtunk, amelyből a lemez egyik pozíciójára 1 μl-t cseppentettünk fel. A csepp beszáradását követően a mintákra 1 μl α-HCCA (10 mg/ml α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid) mátrix oldatot vittünk fel és a mintát ismét hagytuk beszáradni. Valamennyi minta esetében 6 párhuzamos mérést végeztünk.

Az izolátumok azonosítása során MALDI Biotyper 3.1 szoftvert alkalmaztunk, amely a kapott tömegspektrumokat az adatbázisában szereplő referencia tömegspektrumokhoz hasonlítja és egy megfelelőségi faktort (score) számít ki. 2,300 – 3,000 log score érték esetén az azonosság igen valószínű. Ekkora log score érték esetén a faj azonosítottnak tekinthető. Amennyiben 2,000 – 2,299 közötti log score értéket kapunk, az azonosság kisebb, így ez esetben csak a mikroorganizmus nemzetsége tekinthető azonosítottnak. 1,700 – 1,999 log score érték között a nemzetség (genus) azonosítása sem tekinthető megfelelően biztosnak. Ha az értékelő szoftver 0,000 – 1,699 közötti log score értéket ad meg, az azonosítást sikertelennek kell tekinteni. A vizsgálatba bevont koaguláz-pozitív Staphylococcus törzsek azonosítását korábban végeztük el [24].

3.3. Antibiotikum érzékenységi vizsgálat

3.3.1. Methicillin-rezisztencia specifikus csúcsok vizsgálata MALDI-TOF-MS módszerrel

A kapott tömegspektrumokat a flexAnalysis 3.4 szoftverbe (Bruker Daltonics) exportáltuk és elvégeztük a tömegspektrumok manuális elemzését és összehasonlítását. A tömegspektrumok simítását a Savitzky–Golay szűrővel, az alapvonal korrekcióját pedig a TopHat algoritmussal végeztük el. Az elemzés során a methicillin-rezisztencia (MR) specifikus fragment ionok jelenlétét vizsgáltuk (1. táblázat).

1. táblázat. A vizsgálatban tesztelt methicillin-rezisztencia (MR) specifikus csúcsok

3.3.2. Korongdiffúziós módszer

A törzsek antibiotikum-rezisztenciájának vizsgálata során a CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) által meghatározott előírásoknak (2019) megfelelően jártunk el [25]. A 0,5 McFarland egységnyi baktérium-szuszpenziót Mueller-Hinton agar (Oxoid, UK) felületére szélesztettük, majd a táptalaj felületére helyeztük a Cefoxitin 30 μg korongokat. A törzseket 37 °C-on, 18 órán át inkubáltuk. Az MRSA törzsek esetében a feltisztulási zóna referencia tartománya 6-19 mm volt, míg mecA negatív fajoknál 20-32 mm.

3.3.3. Szelektív differenciáló agar

Az antibiotikum rezisztencia vizsgálatok során továbbá a CHROMagar MRSAII szelektív differenciáló táptalajt (BD, UK) alkalmaztunk, amely a methicillin-rezisztens Staphylococcus aureus fajok kimutatására szolgál. Az izolátumokat 37 °C-on 24-48 órán keresztül inkubáltuk aerob körülmények között. MRSA baktériumnak tekintettük azokat a törzseket, amelyek morfológiailag Staphylococcusokhoz hasonló mályvaszínű telepeket képeztek. A korongdiffúziós (Cefoxitin 30 µg) módszert és az MRSA CHROMagar vizsgálatot minden élelmiszerből izolált törzs (n=77) esetében kétszer ismételtük meg. A vizsgálatok során pozitív kontrollként az ATCC 33591 referencia MRSA törzset, negatív kontrollként pedig az ATCC 29213 MSSA törzset használtuk.

3.3.4. mecA génkomplex

A mecA gén kimutatásának vizsgálatát a Dán Nemzeti Élelmiszertudományi Intézet (National Food Institute – NFI) 2012-ben kiadott protokollja alapján végeztük el [26]. A vizsgálat során pozitív kontrollként az ATCC 43300 MRSA törzset, míg negatív kontrollként az ATCC 29213 MSSA törzset használtuk. A baktériumokból genomi DNS-t izoláltunk, majd a mecA génszakaszt PCR segítségével felszaporítottuk. Az alkalmazott primereket a 2. táblázat tartalmazza.

2. táblázat. A mecA gén felszaporításához alkalmazott primerek

3.4. A methicillin-rezisztens Staphylococcus törzsek MLST vizsgálata

THOMAS és munkatársai [27] tanulmánya alapján a baktériumokból genomi DNS-t izoláltunk, majd a 7 db Staphylococcus aureus fajra specifikus génszakaszt PCR segítségével felszaporítottuk (3. táblázat). Meghatároztuk a megtisztított PCR termékek nukleotid sorrendjét majd a szekvencia adatokat BioNumerics 7.6 szoftverben értékeltük.

3. táblázat. MLST módszer során alkalmazott gének és a felszaporításukhoz használt primerek adatai

4. Eredmények

4.1. Az izolált törzsek azonosítási eredményei

A MALDI-TOF-MS vizsgálat során minden koaguláz-pozitív Staphylococcus (CPS) törzs (n=47) S. aureus fajnak bizonyult (4. és 6. táblázat). A koaguláz-negatív Staphylococcus (CNS) törzsek esetében pedig 8 különböző fajt (S. xylosus, S. saprophyticus, S. pasteuri, S. epidermidis, S. warneri, S. chromogenes, S. piscifermentans, S. haemolyticus) azonosítottunk (4. és 7. táblázat). A CNS (n=30) izolátumok 30%-a S. warneri fajnak, míg 23%-a S. pasteuri fajnak bizonyult. A S. aureus törzsek 70%-át, míg a CNS törzsek mindegyikét hús és húskészítményekből izoláltuk (1. és 2. ábra). A S. aureus törzsek esetében a hús és húskészítmények 64%-a, míg a CNS törzsek 70%-a sertésből származott. A hús és húskészítményeken belül, a baromfiból és marhából származó izolátumok megoszlása közel azonos volt.

1. ábra. A S. aureus törzsek megoszlása élelmiszercsoportonként
2. ábra. A CNS törzsek megoszlása élelmiszercsoportonként

Az izolátumok átlag azonosítási log score értékeit és azok szórását a 4. táblázat foglalja össze. A S. aureus izolátumok átlag azonosítási log score értéke meghaladta a 2,400-et. A legalacsonyabb log score érték 2,304 volt, azonban még ebben az esetben is biztonságosnak tekinthető az azonosítás. A CNS izolátumok vizsgálata során, minden fajt 2,300 log score érték felett azonosítottunk és a szórás egyik esetben sem haladta meg a 0,1 értéket.

4. táblázat. Azonosított koaguláz-pozitív és -negatív Staphylococcus fajok azonosítási log score értékei

4.2. A MALDI-TOF-MS technikával meghatározott methicillin-rezisztencia eredményei

Az izolátumokból nyert tömegspektrumok elemzése során 3 antibiotikum-rezisztencia specifikus csúcsot vizsgáltunk meg. A 2414 m/z csúcs a mecA gén egyik fehérjeterméke [28], ezért ennek a csúcsnak a jelenlétét illetve hiányát minden törzs esetében megvizsgáltuk. A 7239 m/z csúcs detektálhatóságát csak a S. epidermidis fajokban, míg a 9674 m/z csúcs jelenlétét/hiányát csak a S. haemolyticus fajokban vizsgáltuk a csúcsok fajspecificitása miatt.

A 2414 m/z csúcsot a 77 izolátum közül, két S. aureus törzsben detektáltuk, amelyek közül az egyik libamájból (SA-17) a másik pedig sertés tarjából (SA-47) származik. A további 75 izolátum esetében ez a csúcs még alacsony intenzitással sem jelent meg (5. táblázat). Az elemzés során a methicillin-rezisztensnek bizonyult két S. aureus törzset pirossal, míg a többi, methicillin-rezisztencia specifikus csúcsot nem tartalmazó S. aureus törzsek tömegspektrumait feketével jelöltük (3. és 4. ábra).

A 7239 m/z egyik S. epidermidis törzsben (n=4) sem volt detektálható és a 9674 m/z csúcs a 4 S. haemolyticus faj egyikében sem jelent meg.

3. ábra. A 2414 m/z átmenet tömegspektruma
4. ábra. A 47 Staphylococcus törzs tömegspektruma
5. táblázat. Specifikus ion fragment-értékek előfordulási gyakorisága az élelmiszerekből izolált Staphylococcus törzsekben

4.3. A korongdiffúziós módszer és az MRSA CHROMagar szelektív differenciáló agar eredményei

A 77 törzs vizsgálata során 75 törzs esetében a feltisztulási zóna átmérője 23-29 mm közé esett. Egy libamájból izolált törzs (SA-17) feltisztulási zónája 9 mm, egy sertéstarjából izolált törzs (SA-47) feltisztulási zónája pedig 17 mm átmérőjű volt és ugyanezen törzsek mályvaszínű telepeket képeztek az MRSA CHROMagar szelektív differenciáló táptalajon is (6. és 7. táblázat).

6. táblázat. Az élelmiszerekből azonosított S. aureus törzsek antibiotikum rezisztencia vizsgálatok eredményei
7. táblázat. Az élelmiszerekből azonosított koaguláz-negatív Staphylococcus törzsek antibiotikum rezisztencia vizsgálatok eredményei

4.4. mecA gén kimutatás eredményei

A MALDI-TOF-MS vizsgálatok, a korongdiffúziós módszer és az MRSA szelektív, differenciáló táptalaj eredményei alapján kiderült, hogy a libamájból és sertés tarjából izolált S. aureus törzsek (SA-17, SA-47) methicillin-rezisztenciát hordoznak, amelyet a két törzsben kimutatható, a PBP2a szintéziséért felelős mecA gén erősített meg (6. táblázat).

4.5. Az MRSA törzsek MLST típusa

A vizsgálat során elvégeztük a két MRSA törzs MLST tipizálását is, amely során a PubMLST honlapon (https://pubmlst.org/saureus/) elérhető adatbázisban szereplő adatokat használtuk. A BioNumerics 7.6 szoftver a két MRSA törzs közül csak a sertés tarjából izolált törzs esetében tudta hozzárendelni a szekvencia típust.

A libamájból izolált törzs egy eddig még nem ismert szekvencia típusba, míg a sertés tarjából izolált törzs a 398-as szekvencia típusba tartozott (8. táblázat).

8. táblázat. Az élelmiszerekből izolált MRSA törzsek MLST típusa

5. Összefoglalás és következtetés

A vizsgálat során különböző élelmiszer mátrixokból 77 Staphylococcus izolátumot gyűjtöttünk az MSZ EN ISO 6888-1:2008 szabványban leírt módszerek alapján. A szabvány ugyan lehetővé teszi a koaguláz-pozitív és koaguláz-negatív Staphylococcus fajok elkülönítését, azonban a faji identifikálást nem, amely a fajok eltérő virulencia faktorai és patogenitása szempontjából számottevő. Az élelmiszerekből izolált 47 koaguláz-pozitív és 30 koaguláz-negatív Staphylococcus törzs azonosítását MALDI-TOF-MS technikával végeztük el, magas azonosítási log score értékekkel. Emellett a kapott tömegspektrumok elemzésével, korábbi tanulmányokban meghatározott methicillin-rezisztencia specifikus ion fragment-értékek alapján két S. aureus törzs esetében methicillin-rezisztenciát állapítottunk meg, amelyet korongdiffúziós módszerrel, szelektív differenciáló agarral és a mecA gén kimutatásával igazoltunk. A specifikus ion fragment értékeknek köszönhetően jelentősen csökkenthető a diagnosztikai idő, amely gazdasági és terápiás szempontból sem elhanyagolható. Azt azonban figyelembe kell vennünk, hogy az MRSA törzsek nagy variabilitásának köszönhetően ezeknek az ion fragment értékeknek a szenzitivitása és specificitása nem 100%-os, így megerősítő vizsgálatok elvégzése szükséges.

Az élelmiszerekből izolált két MRSA törzsnek elvégeztük a multilókusz szekvencia tipizálását (MLST), a törzsek epidemiológiai vizsgálata céljából. A sertéshúsból származó izolátum az ST398 típusba tartozott, amely a mezőgazdasági haszonállatokból izolált MRSA törzsek leggyakoribb típusa az EU/EGT területén. Figyelembe véve azonban az ST398-as típusú törzsek specifikus gazdaszervezet adaptációs képességeit, miszerint azok nem csak sertésekben, hanem más állatfajokban és a humán szervezetben is képesek megtapadni, a kontamináció és a fertőződés számos módon létrejöhet az élelmiszer-feldolgozás technológiai lépései során is.

Tekintve, hogy az élelmiszerekből izolált 47 S. aureus törzs közül 2 törzs is methicillin-rezisztensnek bizonyult, e tény igazolja a globálisan növekvő antibiotikum-rezisztencia okozta veszélyeket, ezáltal a helyzet súlyosságát és aktualitását is jelzi.

6. Köszönetnyilvánítás

A tanulmány a WESSLING Hungary Kft., a BIOMI Kft. és az Innovációs és Technológiai Minisztérium ÚNKP-19-3-III kódszámú Új Nemzeti Kiválóság Programjának szakmai támogatásával készült.

7. Irodalom

[1] Böröcz, K. (2001): A magyarországi nosocomialis MRSA járványok tapasztalatai (1993-2000). Epidemiológiai Információs Hetilap. 8. (10-11).

[2] Böröcz, K. (2005): Az Országos tisztifőorvos állásfoglalása a methicillin-rezisztens Staphylococcus aureus (MRSA) törzsek által okozott, egészségügyi ellátással összefüggő fertőzések megelőzésükről és terjedésük megakadályozásáról. Epidemiológiai Információs Hetilap. 12. (5).

[3] Jungwhan, C., Kidon, S., Saeed, K. (2017): Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in Food-Producing and Companion Animals and Food Products. Frontiers in Staphylococcus aureus. Intechopen.

[4] Lim, D., Strynadka, N. C. J. (2002): Structural basis for the β-lactam resistance of PBP2a from metichillin-resistant Staphylococcus aureus. Nature Structural Biology. 9 (11), pp. 870-876. https://doi.org/10.1038/nsb858

[5] Ito, T., Katayama, Y., Hiramatsu, K. (1999): Cloning and nucleotide sequence determination of the entire mec DNA of pre-methicillin-resistant Staphylococcus aureus N315. Antimicrob Agents Chemother. 43 (6), pp. 1449-58. https://doi.org/10.1128/AAC.43.6.1449

[6] Wielders, C. L., Vriens, M. R., Brisse, S., De Graaf-Miltenburg, L. A., Troelstra, A., Fleer, A., Schmitz, F. J., Verhoef, J., Fluit, A. C. (2001): In-vivo transfer of mecA DNA to Staphylococcus aureus [corrected]. Lancet. 26; 357 (9269), pp. 1674-1675. https://doi.org/10.1016/S0140-6736(00)04832-7

[7] Köck, R., Harlizius, J., Bressan, N., Laerberg, R., Wieler, L. H., Witte, W., Deurenberg, R. H., Voss, A., Becker, K., Friedrich, A. W. (2009): Prevalence and Molecular Characteristics of Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA) Among Pigs on German Farms and Import of Livestock-Related MRSA Into Hospitals. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 28 (11), pp. 1375-1382. https://doi.org/10.1007/s10096-009-0795-4

[8] Agersø, Y., Hasman, H., Cavaco, L. M., Pedersen, K., Aarestrup, F. M. (2012): Study of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in Danish pigs at slaughter and in imported retail meat reveals a novel MRSA type in slaughter pigs. Veterinary Microbiology. 157 (1-2), pp. 246-250. https://doi.org/10.1016/j.vetmic.2011.12.023

[9] Argudín, M. A., Tenhagen, B. A., Fetsch, A., Sachsenröder, J., Käsbohrer, A. (2011): Virulence and resistance determinants of German Staphylococcus aureus ST398 isolates from nonhuman sources. Applied and Environmental Microbiology. 77 (9), pp. 3052-3060 https://doi.org/10.1128/AEM.02260-10

[10] Juhász-Kaszanyitzky, E., Jánosi, S., Somogyi, P., Dán, A., Van Der, A., Graaf-Van Bloois, L. (2007): MRSA transmission between cows and humans. Emerging Infectious Diseases. 13 (4), pp. 630-632. https://doi.org/10.3201/eid1304.060833

[11] Albert, E., Sipos, R., Jánosi, Sz., Kovács, P., Kenéz, Á., Micsinai, A., Noszály, Zs., Biksi, I. (2020): Occurrence and characterisation of methicillin-resistant Staphylococcus aureus isolated from bovine milk in Hungary. Acta Veterinaria Hungarica. 68 (3) pp. 236-241. https://doi.org/10.1556/004.2020.00040

[12] Wendlandt, S., Schwarz, S., Silley, P. (2013): Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus: A Food-Borne Pathogen? Annual Review of Food Science and Technology. 4, pp. 117-139. https://doi.org/10.1146/annurev-food-030212-182653

[13] Bosch, T., Verkade, E., Van Luit, M., Landman, F., Kluytmans, J., Schouls, L. M. (2015): Transmission andpersistence of livestock-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus among veterinarians and their household members. Applied and Environmental Microbiology. 81 (1), pp. 124-129. https://doi.org/10.1128/AEM.02803-14

[14] Fluit, A.C. (2012): Livestock-associated Staphylococcus aureus. Clinical Microbiology and Infection. 18 (8), pp. 735-744. https://doi.org/10.1111/j.1469-0691.2012.03846.x

[15] Verkade, E., Van Benthem, B., Den Bergh, M. K., Van Cleef, B., Van Rijen, M., Bosch, T., Kluytmans, J. (2013): Dynamics and determinants of Staphylococcus aureus carriage in livestock veterinarians: a prospective cohort study. Clinical Infectious Diseases. 57 (2), pp. 11-17. https://doi.org/10.1093/cid/cit228

[16] Fowoyo, P. T. - Ogunbanwo, S. T. (2017): Antimicrobial resistance in coagulase-negative staphylococci from Nigerian traditional fermented foods. Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials, 16 (4), pp. 2-7. https://doi.org/10.1186/s12941-017-0181-5

[17] Chaje, W., Zadernowska, A. C.-W., Nalepa, B., Sierpinska, M., - Łaniewska-Trokenheim, L. (2015): Coagulase-negative staphylococci (CoNS) isolated from ready-to-eat food of animal origin e Phenotypic and genotypic antibiotic resistance. Food Microbiology, 46, pp. 222-226. https://doi.org/10.1016/j.fm.2014.08.001

[18] European Food Safety Authority - EFSA (2018): The European Union summary report on antimicrobial resistance in zoonotic and indicator bacteria from humans, animals and food in 2016. EFSA journal. 16 (2), pp. 5182. https://doi.org/10.2903/j.efsa.2018.5182

[19] Aires-De-Sousa, M. (2016): Methicillin-resistant Staphylococcus aureus among animals: current overview. Clinical Microbiology and Infection. 23, pp. 373-380. https://doi.org/10.1016/j.cmi.2016.11.002

[20] Josten, M., Dischinger, J,. Szekat, C., Reif, M., Al-Sabti, N., Sahl, H. G., Parcina, M., Bekeredjian-Ding, I, Bierbaum, G. (2014): Identification of Agr-Positive Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus Harbouring the Class A Mec Complex by MALDI-TOF Mass Spectrometry. International Journal of Medical Microbiology. 304 (8), pp. 1018-1023. https://doi.org/10.1016/j.ijmm.2014.07.005

[21] Alksne, L., Makarova, S., Avsejenko, J., Cibrovska, A., Trofimova, J., Valciņa, O. (2020): Determination of methicillin-resistant Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis by MALDI-TOF-MS in clinical isolates from Latvia. Clinical Mass Spectrometry. 16, pp. 33-39. https://doi.org/10.1016/j.clinms.2020.03.001

[22] Pranada, A. B. - Bienia, M. - Kostrzewa, M. (2016): Optimization and Evaluation of MRSA Detection by Peak Analysis of MALDI-TOF Mass Spectra, in DGHM 2016 https://www.msacl.org/view_abstract/MSACL_2017_EU.php?id=305 Hozzáférés: 2021.01.08.

[23] Manukumar, H. M., Umesha, S. (2017): MALDI-TOF-MS based identification and molecular characterization of food associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Scientific Reports. 7, 11414 pp. 1-16. https://doi.org/10.1038/s41598-017-11597-z

[24] Horvath, B., Peles, F., Szél, A., Sipos, R., Erős, Á., Albert, E., Micsinai, A. (2020): Molecular typing of foodborne coagulase-positive Staphylococcus isolates identified by MALDI-TOF-MS. Acta Alimentaria, An International Journal of Food Science. 49 (3), pp. 307-313. https://doi.org/10.1556/066.2020.49.3.9

[25] Clinical and Laboratory Standards Institute - CLSI (2019): Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing: Eighteenth Informational Supplement M100- S18. Wayne, PA, USA: CLSI.

[26] National Food Institute - NFI (2012): protocol for pcr amplification of meca, mecc (mecalga251), spa and pvl recommended by the eurl-ar 2st version. https://www.eurl-ar.eu/CustomerData/Files/Folders/21-protocols/279_pcr-spa-pvl-meca-mecc-sept12.pdf Hozzáférés: 2021.02.03.

[27] Thomas, J. C., Vargas, M. R., Miragaia, M., Peacock, S. J., Archer, G. L., Enright, M. (2007): Improved Multilocus Sequence Typing Scheme for Staphylococcus epidermidis. Journal of Clinical Microbiology. 45 (2), pp. 616-619. https://doi.org/10.1128/JCM.01934-06

[28] Josten, M., Dischinger, J,. Szekat, C., Reif, M., Al-Sabti, N., Sahl, H. G., Parcina, M., Bekeredjian-Ding, I, Bierbaum, G. (2014): Identification of Agr-Positive Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus Harbouring the Class A Mec Complex by MALDI-TOF Mass Spectrometry. International Journal of Medical Microbiology. 304 (8), pp. 1018-1023. https://doi.org/10.1016/j.ijmm.2014.07.005

Tovább a cikk olvasásához


A laktációszám és a laktáció stádium hatása a tejmennyiségre, a nyers tehéntej összetételére és mikrobiológiai tulajdonságaira egy hazai tehenészeti telepen

Cikk letöltése PDF formátumban

A laktációszám és a laktáció stádium hatása a tejmennyiségre, a nyers tehéntej összetételére és mikrobiológiai tulajdonságaira egy hazai tehenészeti telepen

DOI: https://doi.org/10.52091/EVIK-2021/2-3-HUN

Érkezett: 2020. július – Elfogadva: 2020. november

Szerzők

1 Debreceni Egyetem, Mezőgazdaság-, Élelmiszertudományi és Környezetgazdálkodási Kar, Élelmiszertudományi Intézet
2 Debreceni Egyetem, Mezőgazdaság-, Élelmiszertudományi és Környezetgazdálkodási Kar, Állattudományi, Biotechnológiai és Természetvédelmi Intézet, Állattenyésztési nem önálló Tanszék
3 Debreceni Egyetem, Állattenyésztési Tudományok Doktori Iskola

Kulcsszavak

laktációszám, laktáció stádium, tehéntej, tejmennyiség, tejösszetétel, mikrobiológia

1. Összefoglalás

A tej összetételének és higiéniai tulajdonságainak változásai befolyásolják a termelői árat, ezért elengedhetetlen, hogy a felelős tejtermelő információt gyűjtsön ezen paraméterek különböző tényezők hatására bekövetkező változásairól. A szerzők a tanulmányukban arra keresik a választ, hogy tapasztalható-e változás a tehenek napi tejmennyiségében, illetve a nyers tehéntej összetételében (zsír- és fehérjetartalom) és mikrobiológiai tulajdonságaiban (szomatikus sejtszám, összcsíraszám, coliform- és S. aureus-szám) az egyszer és többször ellett teheneknél, illetve a laktációjuk különböző stádiumaiban. Egy hazai nagyüzemi tejtermelő telep adatai alapján megállapították, hogy a tej zsír- és fehérjetartalmában ugyan nem volt különbség, de a többször ellett teheneknél nagyobb volt a napi tejhozam, valamint az egyszer ellett tehenek tejéhez képest a tejben magasabb volt a szomatikus sejtszám és nagyobb mennyiségben fordultak elő coliform baktériumok. A napi tejmennyiség a laktáció egymást követő stádiumaiban csökkent, viszont a tej zsír- és fehérjetartalma növekedést mutatott, amely feltételezhetően a csökkenő tejmennyiség koncentráló hatásának tulajdonítható. A mikroorganizmusok telepszámában a laktáció különböző stádiumaiban nem tapasztaltak jelentős változást.

2. Bevezetés

A tehéntejnek magas a tápértéke; többek között zsírokat, fehérjéket, szénhidrátokat, vitaminokat és ásványi anyagokat tartalmaz [1]. A tej összetételének vizsgálata a tejelő állományok higiéniai, táplálkozási és egészségügyi szempontjainak figyelemmel kísérésére céljából a tejgazdaságokban rutinszerű gyakorlat [2]. A tej összetételét számos tényező befolyásolhatja, többek között a laktációk száma, a laktáció stádiuma, az évszak, valamint a takarmányozási technológia is [3, 4, 5]. A tej összetétele tehát változhat a laktációk során, és a különböző környezeti tényezők kölcsönhatásainak eredményeként különbségek lehetnek különböző tejtermelő tehenészetek között is [6]. Dürr et al. szerint kiemelkedően fontos a tejhozamra és a tej összetételére vonatkozó eltérések okainak és következményeinek meghatározása érdekében adatbázisok létrehozása. Az adatbázisnak tartalmaznia kell ezen paraméterekre és a laktációkkal kapcsolatos eseményekre vonatkozó, egyedekre vonatkozó feljegyzéseket is [7].

A tej tápértéke, magas vízaktivitása és semleges pH-ja révén kitűnő táptalajként szolgál a különféle mikroorganizmusok számára, amelyek között patogén szervezetek is előfordulhatnak, például Campylobacter jejuni, Salmonella spp., Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Yersinia enterocolitica stb. [8, 9]. A tej elsődleges fertőződése során maguk a beteg állatok a fertőződés forrásai. A szisztémás, kórokozók szóródásával járó betegségben szenvedő tejelő állatok esetében a kórokozók ugyanis kiválasztódhatnak a tejjel. A másodlagos szennyeződéskor a tej kontaminációja környezeti eredetű. A helytelen fejési higiénia miatt a tej többek között az állatok bélsarától, illetve a fejéskor alkalmazott eszközöktől (fejőgépek, tejvezetékek, tejtároló tartályok) szennyeződhet [10]. Ahogy a tej a tejmedencébe, majd a bimbócsatornába kerül, különböző környezeti eredetű mikroorganizmussal fertőződhet, ezért az első tejsugarak baktérium-fertőzöttsége kiemelkedően magas. A fejés megkezdésekor célszerű ezért az első tejsugarakat a továbbiakban fejt tejtől elválasztani, majd annak megsemmisítéséről gondoskodni kell [11]. A tejben lévő baktériumszám csökkentésére leginkább hőkezelést alkalmaznak. A tej kezdeti mikrobiológiai állapota nemcsak az élelmiszer-biztonság szempontjából fontos, de befolyásolhatja az abból készült tejtermékek minőségét is [12].

A coliform baktériumok tőgygyulladást idézhetnek elő a tejtermelő állatokban. A coliform baktériumok által okozott tőgygyulladás csökkentheti a tejelő állatok tejtermelését, gazdasági veszteségeket okozva ezzel a tejtermelő telepeknek [13]. Ezeknek a baktériumoknak a jelenléte a környezetben általános, ezért jelenlétük az élelmiszerben környezeti szennyeződésre utalhat [14, 15].

A nyerstej számos forrásból szennyeződhet S. aureus-szal, például a környezetből, a fejők kezéről, fejőberendezésekről stb. [16]. A S. aureus okozta tőgygyulladás gazdasági kára abból következik, hogy a termelt tej mennyisége lecsökken, minősége leromlik, a benne mért szomatikus sejtszám megnövekszik, a gyengébb minőségű tej felvásárlási ára csökken, így a tejtermelők árbevétele is csökken [17]. A S. aureus elleni védekezés hatékony eszköze a megelőzés. A fertőződés a megfelelő tartási és fejési technológia betartásával, a gyakoribb légyirtással, a tőgybimbó elő- és utófertőtlenítésével, az egyszer használatos tőgytörlő papírok használatával és a laborvizsgálatok rendszeres elvégzésével előzhető meg [18].

A külső és belső tényezők a tej összetételét, és a nyerstej mikrobiológiai állapotát is befolyásolhatják. Utóbbit leginkább a tejjel közvetlenül érintkező felületek higiéniai állapota határozza meg [19]. Peles és munkatársai kutatásai során arra a megállapításra jutottak, hogy a különböző tehénlétszámú tejtermelő gazdaságokban a különféle tartási és fejési módszerek befolyásoló hatást gyakorolnak a tej mikrobiológiai minőségére [20]. Tessema a fajta, az állatok kora, a laktáció száma és a laktáció stádiuma, valamint a S. aureus előfordulásának a valószínűsége között keresett összefüggést.

Tanulmányában a két vizsgált szarvasmarhafajta esetében jelentős különbséget tapasztalt a S. aureus tejben való előfordulására vonatkozóan. A S. aureus nagyobb arányban fordult elő a keresztezett teheneknél, illetve az idősebb egyedek esetében [21]. Bytyqi és munkatársai a különböző fajták tejét vizsgálva nem tapasztaltak különbséget a kapott telepszámok között [22].

Bár magyar tanulmány kevesebb számban készült a témában, több külföldi közleményben vizsgálták, hogy vajon a laktációk száma, laktációk stádiuma befolyással van-e az állatok napi tejmennyiségére, a tej összetételére és mikrobiológiai paramétereire. Tessema szerint a S. aureus prevalenciájában jelentős különbség figyelhető meg aszerint, hogy az állatok hányadik laktációjukban vannak. Tanulmányában megállapította, hogy a S. aureus azoknál a több mint kétszer ellett tehenek tejében fordult elő gyakrabban, amelyek a California Mastitis Test-tel pozitívak voltak [21]. Tenhagen és munkatársai is úgy találták, hogy a S. aureus előfordulásának gyakorisága nő az állatok korával [23]. Ez összefüggésben állhat azzal, hogy a fejések alkalmával a fejőgép megsértheti a tőgybimbókat, így mikroorganizmusok kerülhetnek a környezetből a tőgybe [24]. Egy másik lehetséges ok az, hogy a tejelő állatok egészségügyi állapota azok életkora előrehaladtával romolhat, amelynek kedvezőtlen hatása lehet a tej szomatikus sejtszámára [25].

Vizsgálataink során a célunk az volt, hogy egy hazai nagyüzemi tejtermelő telepen megállapítsuk, hogy van-e különbség az egyszer és a többször ellett, valamint a laktáció különböző stádiumaiban lévő tehenek napi tejmennyiségében, illetve az egyszer és a többször ellett, valamint a laktáció különböző stádiumaiban lévő tehenektől származó tej összetételében (zsír- és fehérjetartalom) és mikrobiológiai paramétereiben (szomatikus sejtszám, összcsíraszám, coliform- és S. aureus-szám).

3. Anyag és módszer

3.1. A mintavétel helye és ideje

Vizsgálatainkba egy Hajdú-Bihar megyében (Magyarország) található tejtermelő telepet vontunk be. A telepen 440–450 holstein-fríz tehenet fejnek. A telepen mélyalmos tartásmódot és monodiétás takarmányozást alkalmaznak. A fejés fejőházban történik, a fejést követően nem végeznek utófertőtlenítést.

A számításokhoz felhasznált napi tejmennyiségre, zsír- és fehérjetartalomra, szomatikus sejtszámra vonatkozó adatok a befejési eredményekből, azaz az Állattenyésztési Teljesítményvizsgáló Kft. által havonta gyűjtött tejminták vizsgálati eredményeiből, a befejési eredményekből származnak. A számításokba 38 egyed valamennyi 2015. május-2020. január közötti befejési eredményét felhasználtuk. A számítások során összegeztük az említett időintervallum alatt a tehenek első laktációjára vonatkozó adatait (n=387), a tehenek 2-5. laktációjára vonatkozó adatait (n=446), továbbá a tehenek laktációjának korai stádiumára (100 nap alatt; n=275), közép stádiumára (100-200 nap; n=249) és a késői stádiumára (200 nap felett; n=309) vonatkozó adatokat.

A mikrobiológiai vizsgálatokat 2018. május és 2019. október között végeztük. A mikrobiológiai vizsgálatokhoz 38 véletlenszerűen kiválasztott, klinikailag egészséges egyedtől összesen 62 tejmintát vettünk. Aszerint, hogy a mintavétel során az állatok hányadik laktációs ciklusban, illetve a laktáció amely stádiumában voltak, a következő csoportokba soroltuk az egyedektől vett mintákat: a 15 egyszer ellett tehéntől 26 mintát, a 23 többször ellett (2-5 ellés) holstein-fríz tehéntől 36 mintát vettünk. Az összesen vett 62 mintából 23-t a laktáció korai stádiumában, 21 mintát a laktáció közép stádiumában, 18 mintát pedig a laktáció végén tartó tehenektől vettünk.

A tőgybimbók előfertőtlenítését, papírtörlővel való szárazra törlését és az első tejsugarak kifejését követően a tehenek mind a négy tőgynegyedéből 50 ml űrtartalmú, zárható steril műanyag mintavételi edényekbe vettünk mintákat. Az edényeket a mintavételt követő két órán belül hűtőtáskában szállítottuk a Debreceni Egyetem Élelmiszertudományi Intézet mikrobiológiai laboratóriumába. A mintákat a mintavételtől számított 24 órán belül feldolgoztuk.

3.2. Mikrobiológiai vizsgálatok

A tejminták előkészítését és az azt követő mikrobiológiai vizsgálatokat Petróczki és munkatársai által leírt eljárás szerint végeztük el [26]. A mintaelőkészítés az MSZ EN ISO 6887-1:2017 [27] szabvány alapján történt, a mintákat a vizsgálat kezdetéig 4 °C-on tároltuk, feldolgozásuk előtt pedig rázással homogenizáltuk. A hígítási sor elkészítéséhez peptonvizet használtunk, amelyet 8,5 g nátrium-klorid (VWR International Kft., Magyarország) és 1,0 g pepton (Merck Kft., Magyarország) 1000 ml desztillált vízben való feloldásával állítottunk elő.

A megfelelő mennyiségek (9-9 ml) kémcsőbe történő kimérését követően a hígítófolyadékot 30 percig 120 °C-on kuktában sterileztük, majd lehűtöttük, végül elkészítettük a decimális hígítási sort.

Az összcsíraszám meghatározása az MSZ EN ISO 4833-1:2014 [28] szabvány szerint történt, amely tejporral kiegészített tripton-glükóz-élesztő (Plate Count Agar, PCA) agar táptalaj (Biolab Zrt., Magyarország) használatát írja elő. Az előírt lemezöntéses módszer végrehajtása után a lemezeket 72 órán át 30 °C-on inkubáltuk.

A coliform baktériumok mennyiségének meghatározását az ISO 4832:2006 [29] szabvány szerint lemezöntéses módszerrel végeztük, steril kristályibolya-epe-laktóz (Violet Red Bile Lactose, VRBL) agart (Biolab Zrt., Magyarország) használatával. Az inkubálás 30 °C-on történt 24 órán át tartott.

A S. aureus meghatározását az MSZ EN ISO 6888-1:2008 [30] szabványnak megfelelően szélesztéses módszerrel hajtottuk végre, amelyhez tojássárga-tellurit emulzióval (LAB-KA Kft., Magyarország) kiegészített Baird-Parker agart (BPA) (Biolab Zrt., Magyarország) használtunk. Az inkubálás 37 °C-on 48 órán át tartott. A S. aureust a többi Staphylococcus fajtól latex agglutinációs teszt (Prolex Staph Xtra Kit, Ferol Kft., Magyarország) alkalmazásával különítettük el.

3.3. Statisztikai analízis

Vizsgálati eredményeink elemzéséhez, leíró statisztika kiszámításához, valamint a mikroorganizmusok mennyiségének logaritmikus transzformációjához, a t-tesztek és a varianciaanalízis elvégzéséhez az SPSS v.22.0 [31] szoftvert alkalmaztuk.

A laktáció-szám esetében a változók összehasonlítását párosítatlan t-próbával, illetve nem paraméteres Mann-Whitney teszttel végeztük, a laktáció-stádium esetében pedig az összehasonlítást egytényezős varianciaanalízissel, illetve nem paraméteres Kruskal-Wallis teszttel végeztük el. Mivel az összcsíraszám, a coliform-szám és a szomatikus sejtszám több esetben nem bizonyult normál eloszlású változónak, e paraméterek esetében logaritmikus transzformációt alkalmaztunk. A statisztikai elemzések során a P<0,05 értéket szignifikáns különbségnek értékeltük.

4. Eredmények

4.1. A laktációszám hatása a tejhozamra, a nyers tej összetételére és mikrobiológiai paramétereire

Az egyszer és a többször ellett tehenek napi tejmennyiségének és az általuk termelt tej zsír- és fehérjetartalmának, továbbá a szomatikus sejtszámának, összcsíraszámának, coliform- és S. aureus-számának átlag és szórásértékeit az 1. táblázat tartalmazza. A vizsgálatra kiválasztott teheneket laktációjuk (egyben ellésük) száma alapján az egyszer, illetve a többször ellett egyedek csoportjaiba soroltuk. Az egyszer ellett tehenek esetében az átlagos tejmennyiség 25,67 kg/nap volt, míg a többször ellett tehenek esetében 31,04 kg/nap. A különbség szignifikáns (P<0,05), ezzel saját kísérleteinkkel is megerősítettük Bondan és munkatársai, valamint Yang és munkatársai megállapítását, miszerint a többször ellett tehenek által leadott napi tejmennyiség több az egyszer ellett tehenekéhez képest [5, 32]. Gurmessa és Melaku keresztezett holstein-fríz tehenek esetében vizsgálták többek között az ellésszám befolyását a tejmennyiségre, azonban nem tapasztaltak különbséget az egyszer és a többször ellett tehenek napi tejmennyisége között [33]. Pratap és kutatócsoportja az egyszer és a többször ellett tehenek napi átlagos tejmennyiségét (6,43±1,39 és 5,89±2,37 l/nap) vizsgálva szintén nem tapasztalt különbséget [34].

A kutatómunkánk során kiválasztott tehenek első laktációja során a tej átlag zsírtartalma 3,74±0,40% volt, míg a kettő, vagy annál több laktáció során vett tejmintákban az átlag zsírtartalom 3,75±0,36% volt. A különbséget nem találtuk szignifikánsnak (P>0,05). Saját eredményeinkhez hasonlóan Gurmessa és Melaku, továbbá Pratap és munkatársai sem tapasztaltak különbséget az egyszer, illetve többször ellett, keresztezett holstein-fríz tehenek tejének átlag zsírtartalma között [33, 34]. Bondan és csoportja viszont azt tapasztalta, hogy a laktációszám befolyásolta a tej zsírtartalmát holstein-fríz tehenekben. Míg az első laktációs tehenek esetében a zsírtartalom 3,47±0,67% volt, a 2-3. laktációs tehenek esetében, valamint a legalább négyszer ellett tehenek esetében 3,43±0,68% és 3,41±0,67% [5]. Shuiep és munkacsoportja a Szudánban készült tanulmányukban helyi és keresztezett tehenek esetében vizsgálták a tej zsírtartalmának változását a laktáció-számmal. A helyi tehenek esetében a negyedik laktációs (többször ellett) teheneknél alacsonyabb volt a tej zsírtartalma (4,82±0,55%), mint a kevesebbszer ellett (1:5,16±0,32; 2:5,22±0,34; 3:5,14±0,34) tehenek esetében. A keresztezett teheneknél nem tapasztaltak különbséget [6]. Yang és munkatársai a kutatásuk során ezzel szemben azt állapították meg, hogy az első laktációs holstein-fríz tehenek esetében volt kevesebb a tej zsírtartalma (3,88%) [32]. A tanulmányunk, illetve a más szakirodalmak változatos eredményei alapján arra a következtetésre jutottunk, hogy a laktációszámon kívül más egyéb tényező is befolyással lehet a tej zsírtartalmára.

Az általunk kiválasztott holstein-fríz tehenek első laktációja során a tej átlag fehérjetartalma 3,24±0,19%, míg a kettő, vagy annál több laktációjuk során vett tejmintákban az átlag fehérjetartalom 3,31±0,16% volt, a különbség nem jelentős (P>0,05). Ez egybevág Gurmessa és Melaku, valamint Pratap és munkatársai megállapításaival, ugyanis a szerzők sem tapasztaltak különbséget az egyszer, illetve többször ellett tehenek tejének átlag fehérjetartalma között [33, 34]. Bondan kutatócsoportja ezzel szemben úgy találta, hogy a laktációszám befolyásolta a tej fehérjetartalmát a holstein-fríz tehenekben. Míg az első laktációs tehenek esetében a fehérjetartalom 3,24±0,37% volt, a 2-3. laktációs tehenek esetében, valamint a legalább négyszer ellett tehenek esetében 3,23±0,38% és 3,19±0,37% [5]. A tej fehérjetartalmának változását a laktáció-számmal Shuiep kutatócsoportja is vizsgálta. A helyi tehenek esetében a negyedik laktációs (többször ellett) időszakba lépett teheneknél alacsonyabb volt a tej fehérjetartalma (3,67±0,19%), mint a kevesebbszer ellett (1:4,01±0,11; 2:3,82±0,12; 3:3,84±0,12) tehenek esetében. A keresztezett teheneknél nem tapasztaltak különbséget [6].

Eredményeink szerint az egyszer ellett tehenek tejében az átlag szomatikus sejtszám [242,2×103 (5,12±0,42 lg) sejt/ml] kevesebb (P<0,05), mint a többször ellett tehenek tejében [356,3×103 (5,39±0,39 lg) sejt/ml]. Az értékek átlagai egyik esetben sem haladták meg a 853/2004/EK rendeletben meghatározott határértéket [M=400,0×103 (5,60 lg) tke/ml] [35]. A hazai tejtermelő telepen kapott eredmények egybevágnak a vonatkozó szakirodalmakkal.

Mikó és munkatársai szerint a laktáció számának növekedésével a tej szomatikus sejtszáma is növekedhet [25]. Ezt a megállapítást Yang és csoportja is tapasztalta [32]. Sheldrake és munkatársai szignifikáns kapcsolatot figyeltek meg az ellésszám és a szomatikus sejtszám között. Megállapították, hogy az ellések számának emelkedésével az egészséges állatok tőgynegyedeiben kisebb mértékű változás történt, azonban a S. aureus-szal fertőzött tőgynegyedek esetében jelentősen nőtt a szomatikus sejtszám [36]. Bondan kutatócsoportja az tapasztalta, hogy a vizsgált holstein tehenek laktációszámának növekedésével a tejben a szomatikus sejtszám is növekedő tendenciát mutatott. Míg az egyszer ellett tehenek esetében az átlag szomatikus sejtszám 4,83±1,73 lg sejt/ml volt, a két-háromszor ellett tehenek, valamint a négy, vagy annál többször ellett tehenek esetében 5,31±1,72 és 5,84±1,62 lg sejt/ml [5].

Az egyszer ellett, azaz első laktációs holstein-fríz tehenektől vett tejmintákban az átlag összcsíraszám 5,1×103 (3,36±0,58 lg) tke/ml volt és 4,6×103 (3,30±0,59 lg) tke ml a többször ellett tehenektől vett tejmintákban azonban a különbség nem volt szignifikáns (P>0,05).

A többször ellett tehenek tejében az átlag coliform-szám [1,1×103 (1,35±1,20 lg) tke/ml] viszont több (P<0,05) volt, mint az egyszer ellett tehenek tejében mért átlag telepszám [1,1×101 (0,65±0,61) lg) tke/ml]. Tenhagen és munkatársai szintén klinikailag egészséges teheneket vontak be a vizsgálatukba, amely során megállapították, hogy a coliform baktériumok bár nagyobb arányban fordultak elő a többször ellett tehenek tejében, nem volt tapasztalható különbség [23].

S. aureus a 26 közül csak egyetlen, egyszer ellett egyedtől származó tejmintában fordult elő, 5,0×101 (1,70 lg) tke/ml mennyiségben, a vizsgált 36 többször ellett egyedtől vett minta közül pedig nyolc egyedi tejmintában tudtuk kimutatni. Ezekben a mintákban az átlag S. aureus szám 1,5×102 (1,92±0,56 lg) tke/ml volt. Az értékek nem haladják meg a 4/1998 (XI. 11.) EüM rendeletben meghatározott határértéket [M=5,0×102 (2,70 lg) tke/ml] [37]. Azon egyedek esetében, amelyeknek tejében a mikrobiológiai vizsgálatok során kimutatható volt a S. aureus, a befejési adatok alapján az átlag szomatikus sejtszámuk 44,3×103 (4,65 lg) sejt/ml és 357,2×103 (5,55 lg) sejt/ml között alakult. Tessema a tanulmányában szintén megállapította, hogy a S. aureus prevalenciája nagyobb a többször (azaz több mint kétszer) ellett tehenek (amelyek a California Mastitis Testtel pozitívak voltak) esetében [21]. Tenhagen és munkatársai szerint a S. aureus előfordulása növekedik az állatok életkorával és a laktáció stádiumával [23].

1. táblázat. Az egyszer és többször ellett tehenek napi tejmennyisége és az általuk termelt tej összetétele és mikrobiológiai tulajdonságai

a, b A táblázat azonos soraiban a különböző betűkkel jelölt értékek szignifikánsan különböznek (P<0,05)

4.2. A laktáció stádium hatása a tejhozamra, a nyers tej összetételére és mikrobiológiai paramétereire

A korai, közép és késői laktációs stádiumban lévő tehenek napi tejmennyiségének és az általuk termelt tej zsír- és fehérjetartalmának, továbbá a szomatikus sejtszámának, összes csíraszámának, coliform- és S. aureus-számának átlag és szórásértékeit a 2. táblázat tartalmazza. A vizsgálatra kiválasztott teheneket laktációjuk stádiuma alapján korai, közép és késői laktáció stádiumú egyedek csoportjaiba soroltuk. Az egyedek napi tejmennyiségének a laktáció stádiumával való változásának a vizsgálata során igazolódott az a szakirodalomban is megtalálható megállapítás, miszerint a laktáció vége felé haladva a napi leadott tejmennyiség csökken. Míg a laktációjuk elején lévő tehenek átlag napi tejmennyisége 32,10±4,73 kg/nap, a laktáció közepén tartó teheneké 29,08±5,09 kg/nap, a laktáció végén tartó teheneké 23,36±3,63 kg/nap. A különbség szignifikáns (P<0,05). Bondan és csoportja hasonló megállapításra jutottak a tanulmányukban. Az általuk vizsgált holstein-fríz tehenek laktációjának 6. és 60. nap közötti időszakában az átlagos tejmennyiség 29,4±8,72 l/tehén/nap volt; azon teheneknek, amelyek laktációjuk 61-120. napján tartottak 29,2±8,66 l/tehén/nap volt; a laktáció 121. és 220. napja közötti intervallumban a tehenek tejmennyisége 26,2±8,01 l/tehén/nap volt, a laktáció végén (>220 nap) pedig 22,0±7,49 l/tehén/nap [5].

Gurmessa és Melaku, valamint Pratap és munkatársai ugyancsak azt tapasztalták, hogy a laktáció elején nagyobb volt az állatok napi tejmennyisége (6,81±1,45 l/nap), mint a laktáció végén (5,48±0,05 l/nap). Vizsgálataik során a laktáció közepén tartó keresztezett holstein-fríz tehenek napi tejmennyisége (7,17±0,05 liter) volt a legnagyobb [33, 34]. Auldist és munkatársai szerint a laktáció-stádium tejmennyiségre gyakorolt hatása (például csökkenése) az emlőmirigyen belüli szekréciós sejtek számának és aktivitásának fiziológiai okból eredő változásából eredhet [2].

A vizsgált egyedek tejének zsírtartalma változást mutat a laktáció vége felé haladva. A laktáció elején, illetve közepén tartó tehenek tejének zsírtartalma átlagosan 3,65±0,43% és 3,59±0,41% volt, amelyek kevesebbnek (P<0,05) mutatkoztak, mint a laktáció végén járó tehenek tejében mért zsírtartalom (3,99±0,47%). A laktáció végén a tejzsír koncentrációjának növekedése összefüggésbe hozható a laktáció előrehaladásával tapasztalható tejhozam-csökkenéssel, ugyanis a csökkenő tejmennyiségnek koncentráló hatása lehet a tej összetételére nézve [2]. A tej zsírtartalma Gurmessa és Melaku közleménye szerint is változik az állatok laktációjának három stádiumában. A laktációjuk elején és végén tartó tehenek esetében a tej átlagos zsírtartalma (4,46±1,44% és 4,46±1,44%) jelentősen magasabb azon tehenek tejéhez (3,70±0,89%) képest, amelyek a laktáció közepén járnak [33]. Bondan és munkatársai közleményében az áll, hogy a tej zsírtartalma a laktáció végén (>200 nap) nagyobb (3,55±0,67%), mint a laktáció korábbi stádiumaiban. Ugyanakkor azt is tapasztalta, hogy a mért átlagos zsírtartalom (3,30±0,66%) a tehenek laktációjának 61. és 120. napja közötti időintervallumban volt a legkevesebb. A laktáció 6. és 60., valamint a 121. és 220. napjai közötti időintervallumában 3,40±0,65% és 3,40±0,66% átlag zsírtartalmat mértek [5]. Shuiep és munkatársai a szudáni helyi és keresztezett tehenek esetében vizsgálták a tej zsírtartalmának változását a laktáció stádiummal. A helyi fajta esetében nem volt különbség a zsírtartalmat illetően a laktáció elején (5,31±0,51%), közepén (4,67±1,56%) és végén (5,28±0,75%). A keresztezett teheneket tekintve azonban a laktáció végén több volt a zsírtartalom (4,45±1,43%), mint a laktáció elején (3,41±1,09%) és közepén (3,33±1,05%) [6].

A zsírtartalomhoz hasonlóan a fehérjetartalom esetében is változás figyelhető meg az időben a laktáció vége felé haladva. A laktáció elején mért átlagos fehérjetartalom 3,08±0,15%, a laktáció közepén 3,20±0,19%, a laktáció végén 3,56±0,20%, a különbség szignifikáns (P<0,05). Bondan és munkatársai hasonló megállapításra jutottak: a laktáció végén (>200 nap) nagyobb fehérjetartalmat (3,41±0,36%) mértek, mint a laktáció korábbi stádiumaiban. Azt is tapasztalták továbbá, hogy a mért átlagos fehérjetartalom (3,03±0,31%) a tehenek laktációjának 61. és 120. napja közötti időintervallumban volt a legkevesebb. A laktáció 6. és 60., valamint a 121. és 220. napok közötti időintervallumban 3,05±0,36% és 3,18±0,32% átlag fehérjetartalmat mértek [5]. Gurmessa és Melaku, valamint Pratap kutatócsoportja nem tapasztaltak különbséget a fehérjetartalmat illetően a laktáció elején (3,55±1,43%), közepén (3,17±0,15%) és végén (3,33±0,16%) lévő tehenek esetében [33, 34].Shuiep és munkatársai a szudáni helyi és keresztezett teheneket illetően vizsgálták a tej fehérjetartalmának változását a laktáció stádiummal. A helyi fajta esetében a laktáció elején (3,87±0,52%) és közepén (3,91±0,18%) több volt a fehérjetartalom az állatok tejében, mint a laktáció végén (3,67±0,17%). A keresztezett tehenek esetében nem volt különbség a zsírtartalmat illetően a laktáció elején (3,67±0,17%), közepén (3,69±0,16%) és végén (3,63±0,22%) [6].

A kutatómunkánk során kiválasztott tehenek laktációjának korai stádiumában az átlagos szomatikus sejtszám 195,1×103 (5,07±0,43 lg) sejt/ml, a laktáció közepén 370,6×103 (5,28±0,50 lg) sejt/ml, a késői laktációs stádiumban 336,4×103 (5,33±0,41 lg) sejt/ml volt. A késői laktációs stádiumban lévő egyedek tejében magasabb (P<0,05) volt a szomatikus sejtszám, mint a laktáció elején lévő tehenek esetében. A laktáció előrehaladásával a szomatikus sejtszám Bondan és munkatársai szerint is növekedő tendenciát mutat. Míg azon holstein-fríz tehenek tejében, amelyeknek laktációja 6. és 60. nap között tartott, az átlagos szomatikus sejtszám 4,79±1,90 lg sejt/ml volt, a laktáció 61. és 120. napja között 4,89±1,90 lg sejt/ml, a laktáció 121. és 220. napja között 5,21±1,75 lg sejt/ml, a 220. napnál tovább tartó laktáció esetében pedig ez a paraméter a vizsgált tehenek tejében 5,53±1,53 lg sejt/ml volt [5].

A holstein-fríz tehenek laktációjának stádiumaiban az összes csíraszámot is meghatároztuk. A laktáció elején az átlagos összes csíraszám 6,8×103 (3,42±0,67 lg) tke/ml, a laktáció közepén 4,4×103 (3,39±0,46 lg) tke/ml, a laktáció végén 2,7×103 (3,13±0,56 lg) tke/ml volt. A kapott összes csíraszám-értékek között nem találtunk szignifikáns különbséget (P>0,05).

A coliform baktériumok számát illetően a legnagyobb telepszámot [1,3×103 (1,30±1,23 lg) tke/ml] a tehenek laktációjának elején vett mintákból mértük, a legkevesebb átlagos coliform- számot [2,2×101 (0,76±0,79 lg) tke/ml] pedig a laktáció közepén vett mintákban mutattuk ki. A laktáció végén vett mintákban az átlagos coliform-szám 1,50×102 (0,90±0,94 lg) tke/ml volt. Az eredmények között nem tapasztaltunk szignifikáns különbséget (P>0,05).

S. aureus a 62 egyedi tejmintából összesen 9 (14,52%) mintában fordult elő átlagosan 1,4×102 (1,89±0,53 lg) tke/ml telepszámban. Abban a hat (9,68%) mintában, amelyek a laktációjuk elején tartó tehenektől származtak, az átlagos S. aureus-szám 1,2×102 (1,81±0,56 lg) tke/ml volt, a laktáció közepén lévő egy (1,61%) állat esetében a S. aureus szám 8,2×101 (1,91 lg) tke/ml volt, a laktáció végén lévő két (3,23%) tehén esetében pedig 2,4×102 (2,15±0,70 lg) tke/ml.

2. táblázat. A korai, közép és késői laktációs stádiumban lévő tehenek napi tejmennyisége és az általuk termelt tej összetétele és mikrobiológiai tulajdonságai

a, b, c A táblázat azonos soraiban a különböző betűkkel jelölt értékek szignifikánsan különböznek (P<0,05)

5. Következtetések

Egy hazai tejgazdaságban végzett kutatómunkánk során igazoltuk, hogy nagyüzemi tartási körülmények között az egyszer ellett tehenek esetében az átlag napi tejmennyiség szignifikánsan kevesebb (P<0,05), mint a többször ellett tehenek esetében. Ennek valószínűleg az az oka, hogy testük fejlődéséhez az első laktációjukban lévő teheneknek van több aminosavra és zsírra szükségük a már több laktációs időszakon átesett állatokhoz képest [38].

A tej zsír- és fehérjetartalmát illetően nem volt szignifikáns különbség az egyszer és a többször ellett tehenek között. Mivel a szakirodalomban a tanulmányunkban kapott eredményekkel megegyező, illetve azoktól eltérő megállapításokkal is találkoztunk, feltételezzük, hogy más tényező (pl. fajta, évszak stb.) is befolyásolja a tej zsír- és fehérjetartalmát, azonban ezeknek a tényezőknek a feltérképezése nem képezte célját a tanulmányunknak. Shuiep és munkatársai közleményükben például két különböző szarvasmarhafajta esetében eltérő eredményekről számolnak be a tej zsír- és fehérjetartalmának a laktációszámmal történő változását vizsgálva [6].

Mérési eredményeink alapján megállapítottuk, hogy a többször ellett tehenektől vett tejmintákban az első laktációs tehenektől vett tejmintákhoz képest szignifikánsan nagyobb (P<0,05) volt a szomatikus sejtszám, illetve a coliform baktérium-szám, de a S. aureus is nagyobb arányban fordult elő. Annak oka, hogy a többször ellett tehenek esetében a mikroorganizmusok nagyobb mennyiségben mérhetők a tejmintákban, egyrészt valószínűleg az, hogy a tőgybimbók a laktációk során károsodhattak (többek között például a fejőgép miatt), amely növelhette a mikroorganizmusok tőgybe jutásának esélyét [24]. Másik oka az lehet, hogy a kor előrehaladtával, illetve a laktációk számának növekedésével a tejelő állatok kondíciója gyengülhetett, amely kedvezőtlenül hathatott például a tej szomatikus sejtszámára [25].

Azt is igazoltuk, hogy a laktáció stádiumaiban a napi leadott tejmennyiség esetén csökkenő tendenciát lehet megfigyelni, viszont a zsír- és fehérjetartalom növekedést mutat. Ez feltételezhetően a csökkenő tejmennyiség koncentráló hatásának tudható be.

A laktáció különböző stádiumaiból vett tejmintákban nem volt tapasztalható különbség az összes csíraszám és a coliform baktériumok telepszámait illetően, azonban a laktáció késői stádiumában a szomatikus sejtszám növekedést mutatott.

6. Köszönetnyilvánítás

A publikáció elkészítését az EFOP-3.6.3-VEKOP-16-2017-00008 számú projekt támogatta. A projekt az Európai Unió támogatásával, az Európai Szociális Alap társfinanszírozásával valósult meg.

Köszönettel tartozom a tejtermelő telep vezetőinek és dolgozóinak a segítőkész közreműködésükért.

7. Irodalom

[1] Hill B., Smythe B., Lindsay D., Shepherd J (2012): Microbiology of raw milk in New Zealand. International Journal of Food Microbiology 157 2 pp. 305-308. https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2012.03.031

[2] Auldist M. J., Walsh B. J., Thomson N. A. (1998): Seasonal and lactational influences on bovine milk composition in New Zealand. Journal of Dairy Research 65 (3) pp. 401-411. https://doi.org/10.1017/S0022029998002970

[3] Heck J. M. L., van Valenberg H. J. F., Dijkstra J., van Hooijdonk A. C. M. (2009): Seasonal variation in the Dutch bovine raw milk composition. Journal of Dairy Science 92 (10) pp. 4745-4755. https://doi.org/10.3168/jds.2009-2146

[4] Lambertz C., Sanker C., Gauly M. (2014): Climatic effects on milk production traits and somatic cell score in lactating Holstein-Friesian cows in different housing systems. Journal of Dairy Science 97 (1) 3 pp. 19-329. https://doi.org/10.3168/jds.2013-7217

[5] Bondan C., Folchini J. A., Noro M., Quadros D. L., Machado K. M., González F. H. D. (2018): Milk composition of Holstein cows: a retrospective study. Ciência Rural 48 (12) pp. 1-8. https://doi.org/10.1590/0103-8478cr20180123

[6] Shuiep E. S., Eltaher H. A., El Zubeir I. E. M. (2016): Effect of Stage of Lactation and order of Parity on Milk Composition and Daily Milk Yield among Local and Crossbred Cows in South Darfur State, Sudan. SUST Journal of Agricultural and Veterinary Sciences (SJAVS) 17 (2) pp. 86-99.

[7] Dürr J. W., Ribas N. P., Costa C. N., Horst J. A., Bondan C. (2011): Milk recording as an indispensable procedure to assure milk quality. Revista Brasileira Zootecnia 40 pp. 76-81.

[8] Quigley L., O’sullivan O., Beresford T. P., Ross R. P., Fitzgerald G. F., Cotter P. D. (2011): Molecular approaches to analysing the microbial composition of raw milk and raw milk cheese. International Journal of Food Microbiology 150 (2-3) pp. 81-94. https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2011.08.001

[9] Claeys W. I., Cardoen S., Daube G., De Block J., Dewettinck K., Dierick K., De Zutter L., Huyghebaert A., Imberechts H., Thiange P., Vandenplas Y., Herman L. (2013): Raw or heated cow milk composition: Review of risks and benefits. Food Control 31 (1) pp. 251-262. https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2012.09.035

[10] Laczay P., Lehel J., Lányi K., László N. (2016): A nyers tejben potenciálisan jelen levő kórokozók közegészségügyi jelentősége. Magyar Állatorvosok Lapja 138 pp. 231-242.

[11] Laczay P. (2008): Élelmiszer-higiénia - Élelmiszerlánc-biztonság. Mezőgazda Kiadó, Budapest.

[12] Cilliers F. P., Gouws P. A., Koutchma T., Engelbrecht Y., Adriaanse C., Swart P. (2014): A microbiological, biochemical, and sensory characterisation of bovine milk treated by heat and ultraviolet (UV) light for manufacturing Cheddar cheese. Innovative Food Science & Emerging Technologies 23 pp. 94-106. https://doi.org/10.1016/j.ifset.2014.03.005

[13] Mbuk E. U., Kwaga J. K. P., Bale J. O. O., Boro L. A., Umoh J. U. (2016): Coliform organisms associated with milk of cows with mastitis and their sensitivity to commonly available antibiotics in Kaduna State, Nigeria. Journal of Veterinary Medicine and Animal Health 8 (12) pp. 228-236. https://doi.org/10.5897/JVMAH2016.0522

[14] Altalhi A. D., Hassan S. A. (2009): Bacterial quality of raw milk investigated by Escherichia coli and isolates analysis for specific virulence-gene markers. Food Control 20 (10) pp. 913-917. https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2009.01.005

[15] Mhone T. A., Matope G., Saidi P. T. (2011): Aerobic bacterial, coliform, Escherichia coli and Staphylococcus aureus counts of raw and processed milk from selected smallholder dairy farms of Zimbabwe. International Journal of Food Microbiology 151 (2) pp. 223-228. https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2011.08.028

[16] Markus G. (2001): A tejelő tehenek tőgygyulladása III. MezőHír. 9

[17] Ózsvári L., Fux A., Illés B. CS., Bíró O. (2003): A Staphylococcus aureus tőgygyulladás által okozott gazdasági veszteségek számszerűsítése egy nagyüzemi holstein-fríz tehenészetben. Magyar Állatorvosok Lapja 125 pp. 579-584.

[18] Rosengren Å., Fabricius A., Guss B., Sylvén S., Lindqvist R (2010): Occurrence of foodborne pathogens and characterization of Staphylococcus aureus in cheese produced on farm-dairies. International Journal of Food Microbiology 144 (2) pp. 263-269. https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2010.10.004

[19] Anderson D., Dulmage D., McDougall M., Séguin G. (2003): General guidelines for effective dairy equipment cleaning. https://www.milk.org/Corporate/pdf/Farmers-UdderEquipmentCleaning.pdf (Hozzáférés: 21. 02. 2020.)

[20] Peles F., Máthéné Sz. Zs., Béri B., Szabó A. (2008): A tartástechnológia hatása a nyers tej mikrobiológiai állapotára. Agrártudományi Közlemények 31 pp. 67-75. https://doi.org/10.34101/actaagrar/31/3009

[21] Tessema F. (2016): Prevalence and Drug Resistance Patterns of Staphylococcus Aureus in Lactating Dairy Cow’s Milk in Wolayta Sodo, Ethiopia. EC Veterinary Science 2 (5) pp. 226-230.

[22] Bytyqi H., Vehapi I., Rexhepi S., Thaqi M., Sallahi D., Mehmeti I. (2013): Impact of Bacterial and Somatic Cells Content on Quality Fresh Milk in Small-Scale Dairy Farms in Kosovo. Food and Nutrition Sciences 4 (10) pp. 1014-1020. https://doi.org/10.4236/fns.2013.410132

[23] Tenhagen B. A., Köster G., Wallmann J., Heuwieser W. (2006): Prevalence of Mastitis Pathogens and Their Resistance Against Antimicrobial Agents in Dairy Cows in Brandenburg, Germany. Journal of Dairy Science 89 (7) pp. 2542-2551. https://doi.org/10.3168/jds.S0022-0302(06)72330-X

[24] Hamann J., Mein G. A., Wetzel S. (1993): Teat tissue reactions to milking: effects of vacuum level. Journal of Dairy Science 76 pp. 1040-1046. https://doi.org/10.3168/jds.S0022-0302(93)77432-9

[25] Mikó E., Baranyi A., Gráff M. (2015): Analysis of somatic cells in cow’s milk. Lucrări Ştiinţifice 17 (1) pp. 290-293.

[27] Magyar Szabványügyi Testület (MSzT) (2017): Élelmiszerek és takarmányok mikrobiológiája. A vizsgálati minták, az alapszuszpenzió és a decimális hígítások elkészítése mikrobiológiai vizsgálathoz. 1. rész: Az alapszuszpenzió és a decimális hígítások elkészítésének általános szabályai. Magyar szabvány MSZ EN ISO 6887-1:2017. Magyar Szabványügyi Testület, Budapest.

[26] Petróczki F. M., Tonamo T. A., Béri B., Peles F. (2019): The effect of breed and stage of lactation on the microbiological status of raw milk. Acta Agraria Debreceniensis 1 pp. 37-45. https://doi.org/10.34101/actaagrar/1/2367

[28] Magyar Szabványügyi Testület (MSzT) (2014): Az élelmiszerlánc mikrobiológiája. Horizontális módszer a mikroorganizmusok számlálására. 1. rész: Telepszámlálás 30 °C-on lemezöntés módszerrel. Magyar szabvány MSZ EN ISO 4833-1:2014. Magyar Szabványügyi Testület, Budapest.

[29] International Organization for Standardization (ISO) (2006): Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for the enumeration of coliforms - Colony-count technique. ISO 4832:2006

[30] Magyar Szabványügyi Testület (MSzT) (2008): Élelmiszerek és takarmányok mikrobiológiája. Horizontális módszer a koagulázpozitív sztafilokokkuszok (Staphylococcus aureus és más fajok) számának meghatározása. 1. rész: Baird-Parker-agar táptalajos eljárás. Magyar szabvány MSZ EN ISO 6888-1:2008. Magyar Szabványügyi Testület, Budapest.

[31] SPSS (2013): SPSS 22.0 for Windows. SPSS Inc., Chicago, IL, USA. Copyright © SPSS Inc., 1989-2013.

[32] Yang L., Yang Q., Yi M., Pang Z. H., Xiong B. H. (2013): Effects of seasonal change and parity on raw milk composition and related indices in Chinese Holstein cows in northern China. Journal of Dairy Science 96 (11) pp. 6863-6869. https://doi.org/10.3168/jds.2013-6846

[33] Gurmessa J., Melaku A. (2012): Effect of Lactation Stage, Pregnancy, Parity and Age on Yield and Major Components of Raw Milk in Bred Cross Holstein Friesian Cows. World Journal of Dairy & Food Sciences 7 (2) pp. 146-149.

[34] Pratap A., Verma D. K., Kumar P., & Singh A. (2014): Effect of Pregnancy, Lactation Stage, Parity and Age on Yield and Components of Raw Milk in Holstein Friesian Cows in organized Dairy form in Allahabad. IOSR Journal of Agriculture and Veterinary Science (IOSR-JAVS) 7 (2) pp. 112-115. https://doi.org/10.9790/2380-0721112115

[35] 853/2004/EK: Az Európai Parlament és a Tanács 853/2004/EK rendelete az állati eredetű élelmiszerek különleges higiéniai szabályainak megállapításáról

[36] Sheldrake R. F., Hoare R. J. T., McGregor G. D. (1983): Lactation Stage, Parity, and Infection Affecting Somatic Cells, Electrical Conductivity, and Serum Albumin in Milk. Journal of Dairy Science 66 pp. 542-547. https://doi.org/10.3168/jds.S0022-0302(83)81823-2

[37] 4/1998. (XI. 11.) EüM rendelet az élelmiszerekben előforduló mikrobiológiai szennyeződések megengedhető mértékéről

[38] Oltner R., Emanuelson M., Wiktorsson H. (1985): Urea concentrations in milk in relation to milk yield, live weight, lactation number and amount and composition of feed given to dairy cows. Livestock Production Science 12 (1) pp. 47-57. https://doi.org/10.1016/0301-6226(85)90039-9

Tovább a cikk olvasásához


Serratia fajok jellemzése, valamint Serratia marcescens kvalitatív kimutatása nyers és pasztőrözött tejből polimeráz láncreakción alapuló vizsgálati módszerrel

Cikk letöltése PDF formátumban

Serratia fajok jellemzése, valamint Serratia marcescens kvalitatív kimutatása nyers és pasztőrözött tejből polimeráz láncreakción alapuló vizsgálati módszerrel

DOI: https://doi.org/10.52091/EVIK-2021/2-4-HUN

Érkezett: 2020. július – Elfogadva: 2020. december

Szerzők

1 Magyar Tejgazdasági Kísérleti Intézet Kft., Mosonmagyaróvár
2 Széchenyi István Egyetem, Wittmann Antal Növény-, Állat- és Élelmiszer-tudományi Multidiszciplináris Doktori Iskola, Mosonmagyaróvár
3 Széchenyi István Egyetem, Mezőgazdaság- és Élelmiszertudományi Kar, Élelmiszertudományi Tanszék, Mosonmagyaróvár

Kulcsszavak

nozokomiális fertőzés, Serratia fajok, Serratia marcescens, patogén, prodigiozin, pigment, polimeráz láncreakció (PCR), élelmiszer-diagnosztika

1. Összefoglalás

A Serratia fajok elsősorban nozokomiális (kórházhigiénés fertőzés – a Szerk.) fertőzőként ismert opportunista patogén mikroorganizmusok, amelyek élelmiszer-minőségi elváltozásokat is okozhatnak. Az extracelluláris pigment-termelő Serratia marcescens tehéntejben való megjelenése annak piros elszíneződését okozza, kihívások elé állítva a tejipart és az élelmiszer-minősítő laboratóriumokat. A baktérium kimutatása hagyományos mikrobiológiai módszereken alapuló eljárásokkal idő- és munkaigényes, ezen túlmenően sok esetben nem is vezet eredményre, a kísérő mikroflóra kompetitív gátló hatása miatt. A vonatkozó szakirodalom elemzését követően a S. marcescens kimutatása kapcsán publikált végpont PCR módszereket és alkalmazott primereket in silico és in vitro vizsgálatban értékeltük, majd az eljárást üzemi tejmintákon teszteltük. A módszer alkalmazásával összesen 60 db nyers, illetve pasztőrözött tejmintát vizsgáltunk meg, amelyeknek több mint felét (32 db-ot) azonosítottuk S. marcescens pozitívként. Munkánk jelentőségét legfőképp a publikált vizsgálati módszerek élelmiszeripari gyakorlatban való alkalmazása adja. Eredményeink felhívják a figyelmet e baktériumfaj detektálásának a fontosságára.

2. Bevezetés és irodalmi áttekintés

Napjainkban az élelmiszerek kifogástalan minősége és hosszú eltarthatósági ideje a vásárlók által támasztott alapkövetelmény. Ennek megfelelően fokozódik az igény az egyre gyorsabb, pontosabb, megbízhatóbb élelmiszer-diagnosztikai eljárások iránt is. A molekuláris diagnosztikai módszerek ezzel összefüggésben mind nagyobb teret nyernek, például a kórokozó mikroorganizmusok gyors kimutatásában. Számos gyártó állít elő polimeráz láncreakción (PCR) alapuló, patogén mikrobák azonosítására alkalmas diagnosztikai kiteket, amelyeket sikerrel alkalmaznak magyarországi élelmiszervizsgáló laboratóriumokban is. Ezek a molekuláris biológiai tesztek főleg olyan mikrobák kimutatására alkalmasak, amelyek jelenléte nagy közegészségügyi kockázatot jelent (például Escherichia coli, Salmonella Typhimurium, Listeria spp.). Kisebb figyelem irányul azokra a kórokozókra, amelyek vizsgálatát jogszabály nem teszi kötelezővé. Ilyen mikróbák például a nyers és pasztőrözött tejben előforduló Serratia fajok is.

A Serratia fajok a környezetünkben sokfelé megtalálhatók [1]. Szaprofiták, illetve opportunista patogének [2]. Fakultatív anaerob, biofilmképző élőlények [1, 3]. A S. marcescens különösen jól szaporodik foszfortartalmú környezetben (például szappanok, samponok), és ellenáll egyes fertőtlenítőszereknek is [4, 5], így különböző nozokomiális betegségek okozója lehet [6, 7, 8]. A szakirodalom beszámol a S. marcescens fokozódó antibiotikum-rezisztenciájáról is [8, 9, 10]. A baktérium tehát könnyen túlél, szaporodik, így nem megfelelő higiénés körülmények között az élelmiszerekbe kerülhet. A fogyasztói tejbe is feltehetően a higiéniai szabályok áthágása következtében juthat, ott elszaporodik és többek között az élelmiszer minőségét is rontja [1, 11, 12]. A romlást némely faj esetén jellegzetes piros színárnyalat jelezi.

A magyarországi tejágazat esetében nem állnak rendelkezésre pontos adatok arról, hogy milyen mértékű a Serratia fajok, illetve a S. marcescens elterjedtsége, és hogy mely fajok okozzák a fertőzéseket, valamint rontják a tej minőségét. Arra vonatkozóan sincs hazai felmérés, hogy milyen mértékű a tejüzemek Serratia-szennyezettsége. Néhány publikációt leszámítva nemzetközi szinten is szegényesek a rendelkezésre álló információk a tejipar Serratia érintettségéről. Ilyen kivétel egy, a finn tejtermelő gazdaságokban tapasztalt, S. marcescens okozta tőgygyulladás-járványt bemutató tudományos cikk [1], valamint egy régebbi beszámoló, amely pigmentképző Serratia fajok masztitiszben játszott szerepét tárgyalja [13].

A tej piros elszíneződéséért a következő Serratia fajok lehetnek felelősek: S. marcescens, S. rubidaea, S. plymuthica és S. nematodiphila (1. táblázat). Előfordulási gyakoriságuk szerint a S. marcescens-nek van nagyobb jelentősége. Jellegzetes pigmentjük a vörös prodigiozin, amely vízben nem oldódó másodlagos anyagcseretermék, és amely meghatározott környezeti körülmények között termelődik [14, 15, 16, 17] (1. ábra). A táptalajon megjelenő tipikus piros telepek önmagukban még nem hordoznak elegendő információt a Serratia azonosításához, ugyanis számos egyéb, nem az enterobaktériumok közé tartozó nemzetség egyes fajai szintén termelhetnek prodigiozint [14, 18].

1. táblázat. Serratia fajok és pigmenttermelésük jellemzése [19–22]
1. ábra. Serratia marcescens tisztatenyészete tripton-szója agaron (TSA) (30 °C, 48 óra)

A Serratia fajok élelmiszerekből történő kimutatására ISO szabvány jelenleg nem áll rendelkezésre. Grimont és Grimont 2006-ban megjelent könyvfejezetében [9] foglalkozik a Serratia nemzetség jellemzőivel, az izolálás és az azonosítás szempontjaival is. A klasszikus mikrobiológiai módszerekkel történő azonosítás azonban meglehetősen körülményes, és a kísérőflóra gátló hatása miatt gyakran eredménytelen is, annak ellenére, hogy a tejminta rózsaszínes elszíneződése szemmel látható. A baktérium szelektív tenyésztésére elérhetők ugyan táptalajok [47], a gyakorlatban viszont ezek használata nem nyújt kielégítő megoldást. A hagyományos eljárások ráadásul idő- és munkaigényesek.

S. marcescens meghatározására létezik kereskedelmi forgalomban lévő gyorsmódszer, például a bioMérieux cég Rapid ID 32 E elnevezésű miniatürizált tesztkészlete, amely megfelel az ISO 7218 szabvány előírásainak [48]. A vizsgálat kivitelezéséhez azonban táptalajon felnövő telep szükséges. A kimutatás nehézségeinek kiküszöbölésére a már korábban említett, PCR módszeren alapuló diagnosztikai tesztek nyújthatnának megoldást. Jelenleg azonban egyedül a Primerdesign cég Genesig fantázianevű terméke említhető S. marcescens kimutatására alkalmas molekuláris diagnosztikai egységcsomagként [49].

Az élelmiszeripari és azon belül a tejipari vonatkozású szakirodalom meglehetősen szegényes a Serratia fajok és köztük S. marcescens végpont PCR vagy real-time PCR módszerrel történő kimutatásának témakörében. Hejazi és munkatársai [50] S. marcescens szerotipizálását végezték el RAPD-PCR technikával. Vizsgálataikhoz kórházi ellátásra szoruló páciensek szerológiai mintáit használták. Iwaya és munkatársai [6] szintén vérmintákat teszteltek S. marcescens törzsekre, real-time PCR módszert alkalmazva. Zhu és munkatársai [51] S. marcescens törzsek molekuláris jellemzését RFLP és PCR módszerrel végezték, míg Joyner és munkatársai [2] real-time PCR vizsgálattal detektáltak S. marcescens törzseket tengeri és egyéb vízi környezeti mintákból (például korall nyák, szivacs pórusvíz, üledék, csatornavíz, szennyvíz és hígított szennyvíz). Bussalleu és Althouse 2018-ben megjelent tanulmánya S. marcescens azonosítására alkalmas, hagyományos végpont PCR-technikáról számol be, amely hatékonyan detektálja a mikroorganizmus jelenlétét vaddisznó spermájában [52].

Célul tűztük ki S. marcescens tejből történő kimutatására alkalmas klasszikus PCR módszer beállítását. Munkánk jelentősége abban áll, hogy a szakirodalomban leírt, PCR vizsgálaton alapuló módszereket és alkalmazott primereket elemeztük, majd a megfelelőnek ítélt eljárást átültettük az élelmiszer-higiéniai vizsgálati gyakorlatba. Kísérleteinkben üzemi, nyers és pasztőrözött tejminták elszíneződésének a hátterében álló esetleges S. marcescens szennyeződés kvalitatív meghatározását végeztük.

3. Anyagok és módszerek

3.1. In silico vizsgálatok

Szakirodalmi közlések alapján kiválasztottunk három primerpárt (2. táblázat), amelyeket számítógépes modellezéssel, ún. in silico analízis során, valamint in vitro kísérletekben értékeltünk abból a célból, hogy a későbbi PCR vizsgálatok megvalósításához megtaláljuk a legalkalmasabbat.

2. táblázat. Alkalmazott Serratia marcescens-specifikus primerpárok

In silico vizsgálatainkban a primer szekvenciák specifikusságát DNS-adatbázissal (NCBI BLAST) [54] történő összehasonlítás útján ellenőriztük. Az adatbázissal történő összevetés a homológia-keresést („blasztolás”) teszi lehetővé. Ezt követően a primerek megfelelőségét, azaz választott genomokon egy lehetséges PCR reakció megvalósulását, molekuláris biológiai szoftverrel (SnapGene 5.1.5.) teszteltük [55]. Az utóbbi esetben az NCBI adatbázisából letöltöttünk pozitív és negatív kontroll genomokat, majd a SnapGene szoftver alkalmazásával vizsgáltuk, hogy in silico módon a primerpárokkal megvalósulhat-e PCR reakció. A referenciának használt pozitív és negatív kontrollok teljes kromoszóma genomok voltak (3. táblázat).

3. táblázat. In silico elemzésben pozitív és negatív kontrollként alkalmazott baktériumtörzsek genomjai, valamint a primerpárokra adott reakcióik

* Primerek: A. Fpfs1 és Rpfs2; B. FluxS1 és RluxS2; C. Serratia2-for és Serratia2-rev.

Jelmagyarázat:

3.2. In vitro kísérletes vizsgálatok

Az in silico vizsgálatok megerősítéseként in vitro kísérleteket végeztünk, amelyek során a kiválasztott primerpárokat laboratóriumi PCR vizsgálatban teszteltük baktériumok (pozitív kontroll törzsként több S. marcescens, negatív kontroll törzsként pedig Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii, Streptococcus thermophilus, Enterococcus faecalis és Micrococcus luteus) választott törzseinek genomi DNS mintáján. A mikroorganizmusok az MTKI Kft. gyűjteményébe tartozó, üzemi környezetből származó, genetikai azonosítással meghatározott baktériumtörzsek voltak.

A PCR reakcióhoz szükséges komponensek összemérése során egy reakcióra 5,2 µL PCR tisztaságú steril vizet, 10 µL DreamTaq Green 2× PCR Master Mixet (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, Egyesült Államok), 0,4–0,4 µL (10 pmol/µl) primert és 4 µL izolált bakteriális genomi DNS-t használtunk. A reakciók negatív kontrollja PCR tisztaságú steril víz volt. A PCR berendezés (Mastercycler Nexus Gradient; Eppendorf International, Hamburg, Németország) programjának paraméterei a következőképpen alakultak: 95 °C 1 perc, majd 40 cikluson keresztül 95 °C 15 másodperc, 59,5 °C 15 másodperc, 72 °C 10 másodperc, végül 72 °C 7 perc [52].

A PCR reakció során képződött DNS szakaszok méret szerinti elválasztáshoz 10 µL mintát vizsgáltunk 2%-os agaróz gélben [TBE puffer (Tris-borate-EDTA) (10×), Thermo Fisher Scientific; Agarose DNA Pure Grade, VWR International, Debrecen, Magyarország; ECO Safe Nucleic Acid Staining Soluion 20.000×, Pacific Image Electronics, Torrance, Kalifornia, Egyesült Államok]. A DNS méretmarker a GeneRuler Low Range DNA Ladder (Thermo Fisher Scientific) volt. A géldokumentálás a Gel Doc Universal Hood II géldokumentációs berendezés és program (Bio-Rad, Hercules, Kalifornia, Egyesült Államok) alkalmazásával történt.

3.3. Nyers és pasztőrözött tejminták vizsgálata

Vizsgálatainkban egyrészt olyan, üzemi nyers és pasztőrözött tejmintákat alkalmaztunk, amelyek kapcsán felmerült a S. marcescens szennyeződés gyanúja azok rózsaszínes elszíneződése miatt. Másrészt teszteltünk az előbbiekkel együtt a laboratóriumba érkezett, elszíneződést azonban nem mutató, szintén üzemi nyers és pasztőrözött tejmintákat is.

A DNS-feltáró és -tisztító folyamathoz NucleoSpin Microbial DNA kitet (Macherey-Nagel, Düren, Németország) alkalmaztunk a gyártói előírások szerint. Az eluált DNS-t tartalmazó reakciócsöveket fagyasztóban tároltuk, -20 °C-on.

A következőkben 16S rDNS polimeráz láncreakcióval kontrolláltuk a DNS izolálás megfelelőségét és a minták amplifikálhatóságát, melyhez a 27f (5’-AGAGTTGATCMTGGCTCAG-3’) és 1492r (5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’) primert alkalmaztuk. A PCR reakció összemérési térfogata 1 mintára: 5,6 µL PCR tisztaságú steril víz, 10 µL DreamTaq Green 2× PCR Master Mix, 0,2–0,2 µL (10 pmol/µl) primerek és 4 µL izolált bakteriális genomi DNS. A reakció negatív kontrollja PCR minőségű steril víz volt. A PCR berendezés programjának paraméterei a következők voltak: 95 °C 4 perc, majd 40 cikluson keresztül 95 °C 20 másodperc, 54 °C 30 másodperc, 72 °C 1 perc, végül 72 °C 5 perc.

A PCR reakció során képződött DNS szakaszok elválasztáshoz 5 µL mintát vizsgáltunk 1%-os agaróz gélben. DNS méretmarker a GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder (Thermo Fisher Scientific) volt. A vizsgált DNS mintát további PCR vizsgálatra alkalmasnak értékeltük, amennyiben az amplifikált DNS fragment kópiáinak hossza a várt méret (~1500 bp) szerint alakult.

Következő lépésben a minták S. marcescens-specifikus PCR vizsgálata és a gélelektroforézis történt a 3.2. In vitro kísérletes vizsgálatok című alfejezetben ismertetett módon. Az eredményeket jelenlét-hiány elv alapján értékeltük.

A módszer megfelelőségének ellenőrzése céljából kontrollvizsgálatban tejminták PCR eredményeit hasonlítottuk össze a néhány esetben meglévő API (bioMérieux, Budapest, Magyarország) vizsgálat eredményeivel. A módszert ezt követően alkalmaztuk S. marcescens jelenlétének nyers és pasztőrözött tejekből történő kimutatására.

4. Eredmények

In silico vizsgálatainkban a primerek homológia vizsgálata során azok elsősorban S. marcescens kromoszóma genomokkal mutattak hasonlóságot. Találtunk azonban egyezést S. rubidaea és S. nematodiphila törzseknél és néhány nem Serratia fajnál is. Az eredményeket figyelembe vettük a SnapGene szoftveres vizsgálatainkhoz tervezett referencia genomok kiválasztásánál. További vizsgálat szükségességét indokolta, hogy a megfelelő homológia, a bázisok illeszkedése még nem jelenti automatikusan egy PCR reakció megvalósulását, mert például a primerek iránya, olvadási hőmérséklete és a képződő PCR termék mérete is meghatározó.

A SnapGene vizsgálatban PCR reakciókat a következő paraméterek mellett prediktáltunk: elemzéseinket legalább 15 bázis egyezése és eltérés (ún. single isolated mismatch) kizárása mellett végeztük. Az olvadási hőmérséklet (melting temperature) legkisebb értéke 50 °C, az amplifikáció eredményeképpen keletkezett fragmentum maximális hossza pedig 3 kbp volt.

Ahogy a 3. táblázatban látható, a Serratia2-for és Serratia2-rev primerpár S. marcescens genomokra illesztve minden esetben mutatott amplifikációt. A PCR reakció általában hat-hét amplikont is eredményezett a 16S rDNS szakaszokon. Az Fpfs1–Rpfs2 és a FluxS1–RluxS2 primerpárok tapadási helye a 16S rDNS-en kívül található a legtöbb S. marcescens törzsben, viszont néhány esetben nem mutattak in silico amplifikációt, érzékenységük tehát nem bizonyult megfelelőnek. A negatív kontroll genomoknál a Serratia2-for és Serratia2-rev primerpár néhány esetben PCR reakció lezajlását jelzi előre bizonyos S. rubidaea és S. nematodiphila törzseknél. Az Fpfs1–Rpfs2 primerek alkalmazásával a PCR reakció egy S. nematodiphila törzs esetén játszódna le. A FluxS1–RluxS2 primerek nem jelezték előre reakció lezajlását egyik választott negatív kontroll genomon sem (3. táblázat).

Az in vitro kísérletekben a pozitív kontrollnak választott S. marcescens genomokon mindhárom primerpár adott jelet a várt fragmentméret szerint, és egyik sem adott jelet a negatív kontrollokon. A Serratia2-for és Serratia2-rev primerpárral végzett vizsgálatot mutatja be a 2. ábra. A negatív mintáknál az 50 bp magasságban megjelenő gyenge jeleket a melléktermékként keletkező aspecifikus DNS darabok, a primer-dimerek felszaporodása okozza.

Az in silico analízisek és az in vitro vizsgálatok eredményei alapján további munkánkhoz a Serratia2-for és Serratia2-rev primereket ítéltük megfelelőnek, annak ellenére, hogy azok specifikussága nem tökéletes. A döntés alapja egyrészt a S. marcescens előfordulásának valószínűsíthető gyakorisága, másrészt a fals negatív vizsgálati eredmények elkerülésének a fontossága volt.

A beállított módszer megfelelőségét ellenőrizendő, kontroll vizsgálatban üzemi tejmintákat teszteltünk. A tejminták (n=10) közül néhány rózsaszínes elszíneződést mutatott. Vizsgálati módszerünkkel kilenc mintát pozitívnak ítéltünk a keresett mikrobára. A minták közül négy esetében API vizsgálati eredménnyel is rendelkeztünk. A négy API-pozitív minta a PCR vizsgálatban is pozitívnak bizonyult. A módszert ezt követően alkalmaztuk S. marcescens nyers és pasztőrözött tejekből történő kimutatására.

A tejminták egy része barackos-rózsaszínes elszíneződést mutatott (3. ábra), ez azonban számos esetben nem volt egyértelmű, a halvány vagy sárgásba hajló színárnyalat miatt. Összesen 60 minta vizsgálatát végeztük el. Ebből 32 db (53,3%) pozitív és 28 db (46,7%) negatív eredményt adott S. marcescens jelenlétére.

A 4. ábrán egyik vizsgálatunk eredményét, a gélelektroforézissel végzett elválasztás képét mutatjuk be. Jól látható, hogy a pozitív kontroll törzs pozitív, a negatív kontroll minta negatív jelet adott, mindemellett három vizsgálati minta esetében pozitív jelet kaptunk. A negatív mintáknál megjelenő gyenge jeleket ebben az esetben is a primer-dimerek felszaporodása okozta.

2. ábra. Serratia2-for és Serratia2-rev primerpárral végzett PCR vizsgálat eredménye választott baktériumtörzsek genomján. Sorok: 1. Serratia marcescens 551R; 2. Serratia marcescens 1911; 3. Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii 0801; 4. Streptococcus thermophilus 1102; 5. Enterococcus faecalis 1101; 6. Micrococcus luteus CLTB1; 7. Negatív kontroll (steril víz); M: Molekulasúly marker
3. ábra. Tejminták. Baloldali minta: Serratia marcescens-negatív, jobboldali minta: Serratia marcescens-pozitív a PCR vizsgálat eredménye alapján
4. ábra. Serratia marcescens-specifikus PCR vizsgálat gélelektroforézis képe. 1.–7.: Tejminták; K+: Pozitív kontroll (Serratia marcescens genomi DNS); K-: Negatív kontroll (steril víz); M: Molekulasúly marker

5. Megbeszélés

Eredményeink értékelésekor fontos figyelembe venni, hogy a PCR vizsgálat a mintában található cél DNS amplifikálására, detektálására alkalmas módszer, amelynek alapján nem lehet megállapítani, hogy az amplifikált S. marcescens-specifikus DNS vajon szaporodóképes, elpusztult, vagy ún. VBNC állapotú sejtekből származik-e. VBNC („viable but not culturable”) állapotban a sejtek életképesek, metabolikusan aktívak, viszont klasszikus, tenyésztéses módszerekkel nem szaporíthatók fel. Az állapot reverzibilis.

Munkánk célja S. marcescens kimutatását szolgáló klasszikus PCR módszer beállítása volt. Az alkalmazott vizsgálati eljárással elvégezhető a tejminták elszíneződésének hátterében álló S. marcescens szennyeződés kvalitatív meghatározása.

Noha itt bemutatott kísérleteinkben a pigmenttermelő S. marcescens kimutatására összpontosítottunk, egy jövőbeli, nemzetség-szintű vizsgálat során mind a 20 Serratia faj (1. táblázat) azonosítása megvalósulhatna. A többi Serratia faj detektálásának jelentőségét az adja, hogy jóllehet a Pseudomonas nemzetség a hűtött nyerstej romlásának legfőbb okozója, ismeretesek a Serratia fajok e tekintetben kimutatható veszélyei is [56]. Pseudomonas törzsekkel együtt ugyanis számos esetben Serratia törzseket is azonosítottak a tej romlásának okozóiként. A Serratia nemzetség tagjait kimutatták tejfeldolgozó üzemekben [3, 12], 4 °C-on tárolt nyerstej-mintákban [56, 57, 58] és tejtartályokban is [59]. Grimont és Grimont [9] már másfél évtizeddel ezelőtt megállapította, hogy a nyerstej-tételek esetenként Serratia fajokkal szennyeződhetnek, a tejtermékekben megjelenő leggyakoribb fajok pedig a S. liquefaciens és a S. grimesii.

A pszichrotróf Serratia fajok (például a S. liquefaciens) nyerstejben való előfordulása a hőkezelés után is minőségroimlást okozhat. Baglinière és munkatársai úgy találták, hogy a S. liquefaciens által termelt hőstabil Ser2 proteáz az UHT tej destabilizációjának jelentős tényezője lehet [11, 60].

Következtetésképpen megállapítható, hogy érdekes és hiánypótló kutatás lenne egy nemzetség-szintű vizsgálat, amelynek révén lehetőség nyílna a nyerstejek ilyen szempontú monitorozására, a Serratia fajok széleskörű detektálására. Az eredmények vélhetően nemcsak a tejgazdaság, tejipar szereplői számára nyújtanának hasznos információkat, hanem a hazai szabályozási és ellenőrzési gyakorlatra is hatással lehetnének.

6. Irodalom

[1] Friman, M.J., Eklund, M.H., Pitkälä, A.H., Rajala-Schultz, P.J., Rantala, M.H.J. (2019): Description of two Serratia marcescens associated mastitis outbreaks in Finnish dairy farms and a review of literature. Acta Veterinaria Scandinavica. 61, pp. 54. https://doi.org/10.1186/s13028-019-0488-7

[2] Joyner, J., Wanless, D., Sinigalliano, C.D., Lipp, E.K. (2014): Use of quantitative real-time PCR for direct detection of Serratia marcescens in marine and other aquatic environments. Applied and Environmental Microbiology. 80, pp. 1679-1683. https://doi.org/10.1128/AEM.02755-13

[3] Cleto, S., Matos, S., Kluskens, L., Vieira, M.J. (2012): Characterization of contaminants from a sanitized milk processing plant. PLoS ONE. 7(6), e40189. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0040189

[4] Langsrud, S., Møretrø, T., Sundheim, G. (2003): Characterization of Serratia marcescens surviving in disinfecting footbaths. Journal of Applied Microbiology. 95, pp. 186-195. https://doi.org/10.1046/j.1365-2672.2003.01968.x

[5] Møretrø, T., Langsrud, S. (2017): Residential bacteria on surfaces in the food industry and their implications for food safety and quality. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. 16, pp. 1022-1041. https://doi.org/10.1111/1541-4337.12283

[6] Iwaya, A., Nakagawa, S., Iwakura, N., Taneike, I., Kurihara, M., Kuwano, T., Gondaira, F., Endo, M., Hatakeyama, K., Yamamoto, T. (2005): Rapid and quantitative detection of blood Serratia marcescens by a real-time PCR assay: Its clinical application and evaluation in a mouse infection model. FEMS Microbiology Letters. 248, pp. 163-170. https://doi.org/10.1016/j.femsle.2005.05.041

[7] Bayramoglu, G., Buruk, K., Dinc, U., Mutlu, M., Yilmaz, G., Aslan, Y. (2011): Investigation of an outbreak of Serratia marcescens in a neonatal intensive care unit. Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 44, pp. 111-115. https://doi.org/10.1016/j.jmii.2010.02.002

[8] Moradigaravand, D., Boinett, C.J., Martin, V., Peacock, S.J., Parkhill, J. (2016): Recent independent emergence of multiple multidrug-resistant Serratia marcescens clones within the United Kingdom and Ireland. Genome Research. 26, pp. 1101-1109. https://doi.org/10.1101/gr.205245.116

[9] Grimont, F., Grimont, P.A.D. (2006): The genus Serratia. Prokaryotes. 6, pp. 219-244. https://doi.org/10.1007/0-387-30746-X_11

[10] Sandner-Miranda, L., Vinuesa, P., Cravioto, A., Morales-Espinosa, R. (2018): The genomic basis of intrinsic and acquired antibiotic resistance in the genus Serratia. Frontiers in Microbiology. 9, pp. 828. https://doi.org/10.3389/fmicb.2018.00828

[11] Baglinière, F., Tanguy, G., Salgado, R.L., Jardin, J., Rousseau, F., Robert, B., Harel-Oger, M., Dantas Vanetti, M.C., Gaucheron, F. (2017): Ser2 from Serratia liquefaciens L53: A new heat stable protease able to destabilize UHT milk during its storage. Food Chemistry. 229, pp. 104-110. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2017.02.054

[12] Salgado, C.A., Baglinière, F., Vanetti, M.C.D. (2020): Spoilage potential of a heat-stable lipase produced by Serratia liquefaciens isolated from cold raw milk. LWT - Food Science and Technology. 126, 109289. https://doi.org/10.1016/j.lwt.2020.109289

[13] Barnum, D.A., Thackeray, E.L., Fish, N.A. (1958): An outbreak of mastitis caused by Serratia marcescens. Canadian Journal of Comparative and Medical Veterinary Science. 22, pp. 392-395.

[14] Malik, K., Tokkas, J., Goyal, S. (2012): Microbial pigments: A review. International Journal of Microbial Resource Technology. 1 (4), pp. 361-365.

[15] Petersen, L.M., Tisa, L.S. (2013): Friend or foe? A review of the mechanisms that drive Serratia towards diverse lifestyles. Canadian Journal of Microbiology. 59, pp. 627-640. https://doi.org/10.1139/cjm-2013-0343

[16] Darshan, N., Manonmani, H.K. (2015): Prodigiosin and its potential applications. Journal of Food Science and Technology. 52, pp. 5393-5407. https://doi.org/10.1007/s13197-015-1740-4

[17] Srimathi, R., Priya, R., Nirmala, M., Malarvizhi, A. (2017): Isolation, identification, optimization of prodigiosin pigment produced by Serratia marcescens and its applications. International Journal of Latest Engineering and Management Research. 2 (9), pp. 11-21.

[18] Giri, A.V., Anandkumar, N., Muthukumaran, G., Pennathur, G. (2004): A novel medium for the enhanced cell growth and production of prodigiosin from Serratia marcescens isolated from soil. BMC Microbiology. 4, pp. 11. https://doi.org/10.1186/1471-2180-4-11

[19] Mahlen, S.D. (2011): Serratia infections: From military experiments to current practice. Clinical Microbiology Reviews. 24, pp. 755-791. https://doi.org/10.1128/CMR.00017-11

[20] Analyzer of Bio-resource Citations (2020): Microorganism Search for Paper, Patent, Genome and Nucleotic. http://abc.wfcc.info/index.jsp. Hozzáférés 2020.04.21.

[21] Birla Institute of Scientific Research, Bioinformatics Centre (2015): Database of Biochemical Tests of Pathogenic Enterobacteriaceae Family. https://bioinfo.bisr.res.in/cgi-bin/project/docter/serratia.cgi. Hozzáférés 2020.04.21.

[22] LPSN (2020): List of Prokaryotic Names with Standing in Nomenclature. https://lpsn.dsmz.de/genus/serratia. Hozzáférés 2020.04.21.

[23] Kämpfer, P., Glaeser, S.P. (2016): Serratia aquatilis sp. nov., isolated from drinking water systems. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 66, pp. 407-413. https://doi.org/10.1099/ijsem.0.000731

[24] Grimont, P.A.D., Jackson, T.A., Ageron, E., Noonan, M.J. (1988): Serratia entomophila sp. nov. associated with amber disease in the New Zealand grass grub Costelytra zealandica. International Journal of Systematic Bacteriology. 38, pp. 1-6. https://doi.org/10.1099/00207713-38-1-1

[25] Grimont, P.A.D., Grimont, F., Starr, M.P. (1979): Serratia ficaria sp. nov., a bacterial species associated with Smyrna figs and the fig wasp Blastophaga psenes. Current Microbiology. 2, pp. 277-282. https://doi.org/10.1007/BF02602859

[26] Anahory, T., Darbas, H., Ongaro, O., Jean-Pierre, H., Mion, P. (1998): Serratia ficaria: A misidentified or unidentified rare cause of human infections in fig tree culture zones. Journal of Clinical Microbiology. 36, pp. 3266-3272. https://doi.org/10.1128/JCM.36.11.3266-3272.1998

[27] Gavini, F., Ferragut, C., Izard, D., Trinel, P.A., Leclerc, H., Lefebvre, B., Mossel, D.A.A. (1979): Serratia fonticola, a new species from water. International Journal of Systematic Bacteriology. 29, pp. 92-101. https://doi.org/10.1099/00207713-29-2-92

[28] Grimont, P.A.D., Grimont, F., Irino, K. (1982): Biochemical characterization of Serratia liquefaciens sensu stricto, Serratia proteamaculans, and Serratia grimesii sp. nov.. Current Microbiology. 7, pp. 69-74. https://doi.org/10.1007/BF01568416

[29] Hennessy, R.C., Dichmann, S.I., Martens, H.J., Zervas, A., Stougaard, P. (2020): Serratia inhibens sp. nov., a new antifungal species isolated from potato (Solanum tuberosum). International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 70, pp. 4204-4211. https://doi.org/10.1099/ijsem.0.004270

[30] Bizio, B. (1823): Lettera di Bartolomeo Bizio al chiarissimo canonico Angelo Bellani sopra il fenomeno della polenta porporina. Biblioteca Italiana, o sia Giornale di Letteratura, Scienze, e Arti (Anno VIII). 30, pp. 275-295.

[31] Williams, R.P., Gott, C.L., Qadri, S.M.H., Scott, R.H. (1971): Influence of temperature of incubation and type of growth medium on pigmentation in Serratia marcescens. Journal of Bacteriology. 106, pp. 438-443. https://doi.org/10.1128/JB.106.2.438-443.1971

[32] Wang, J., Zheng, M.L., Jiao, J.Y., Wang, W.J., Li, S., Xiao, M., Chen, C., Qu, P.H., Li, W.J. (2019): Serratia microhaemolytica sp. nov., isolated from an artificial lake in Southern China. Antonie Van Leeuwenhoek. 112, pp. 1447-1456. https://doi.org/10.1007/s10482-019-01273-9

[33] García-Fraile, P., Chudíčková, M., Benada, O., Pikula, J., Kolařík, M. (2015): Serratia myotis sp. nov. and Serratia vespertilionis sp. nov., isolated from bats hibernating in caves. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 65, pp. 90-94. https://doi.org/10.1099/ijs.0.066407-0

[34] Zhang, C.X., Yang, S.Y., Xu, M.X., Sun, J., Liu, H., Liu, J.R., Liu, H., Kan, F., Sun, J., Lai, R., Zhang, K.Y. (2009): Serratia nematodiphila sp. nov., associated symbiotically with the entomopathogenic nematode Heterorhabditidoides chongmingensis (Rhabditida: Rhabditidae). International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 59, pp. 1603-1608. https://doi.org/10.1099/ijs.0.003871-0

[35] Grimont, P.A.D., Grimont, F., Richard, C., Davis, B.R., Steigerwalt, A.G., Brenner, D.J. (1978): Deoxyribonucleic acid relatedness between Serratia plymuthica and other Serratia species, with a description of Serratia odorifera sp. nov. (type strain: ICPB 3995). International Journal of Systematic Bacteriology. 28, pp. 453-463. https://doi.org/10.1099/00207713-28-4-453

[36] Van Houdt, R., Moons, P., Jansen, A., Vanoirbeek, K., Michiels, C.W. (2005): Genotypic and phenotypic characterization of a biofilm-forming Serratia plymuthica isolate from a raw vegetable processing line. FEMS Microbiology Letters. 246, pp. 265-272. https://doi.org/10.1016/j.femsle.2005.04.016

[37] Zhang, C.W., Zhang, J., Zhao, J.J., Zhao, X., Zhao, D.F., Yin, H.Q., Zhang, X.X. (2017): Serratia oryzae sp. nov., isolated from rice stems. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 67, pp. 2928-2933. https://doi.org/10.1099/ijsem.0.002049

[38] Lehman, K.B., Neumann, R. (1896): Atlas und Grundriss der Bakeriologie und Lehrbuch der Speziellen Bakteriologischen Diagnostik, Volume 11st Ed. J.F. Lehmann, München.

[39] Breed, R.S., Murray, E.G.D., Hitchens, A.P. (Eds.) (1948): Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 6th ed. Williams and Wilkins Co., Baltimore, MD, USA. pp. 1-1529.

[40] Paine, S.G., Stansfield, H. (1919): Studies in bacteriosis. III. A bacterial leaf spot disease of Peotea cynaroides, exhibiting a host reaction of possibly bacteriolytic nature. Annals of Applied Biology. 6, pp. 27-39. https://doi.org/10.1111/j.1744-7348.1919.tb05299.x

[41] Grimont, P.A.D., Grimont, F., Starr, M.P. (1978): Serratia proteamaculans (Paine and Stansfield) comb. nov., a senior subjective synonym of Serratia liquefaciens (Grimes and Hennerty) Bascomb et al. International Journal of Systematic Bacteriology. 28, pp. 503-510. https://doi.org/10.1099/00207713-28-4-503

[42] Ashelford, K.E., Fry, J.C., Bailey, M.J., Day, M.J. (2002): Characterization of Serratia isolates from soil, ecological implications and transfer of Serratia proteamaculans subsp. quinovora Grimont et al. 1982 to Serratia quinovorans corrig., sp. nov.. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 52, pp. 2281-2289. https://doi.org/10.1099/00207713-52-6-2281

[43] Stapp, C. (1940): Bacterium rubidaeum nov. spec. Zentralblatt für Bakteriologie, Parasitenkunde, Infektionskrankheiten und Hygiene, Abt. II. 102, pp. 252-260.

[44] Ewing, W.H., Davis, B.R., Fife, M.A., Lessel, E.F. (1973): Biochemical characterization of Serratia liquefaciens (Grimes and Hennerty) Bascomb et al. (formerly Enterobacter liquefaciens) and Serratia rubidaea (Stapp) comb. nov. and designation of type and neotype strains. International Journal of Systematic Bacteriology. 23, pp. 217-225. https://doi.org/10.1099/00207713-23-3-217

[45] Sabri, A., Leroy, P., Haubruge, E., Hance, T., Frère, I., Destain, J., Thonart, P. (2011): Isolation, pure culture and characterization of Serratia symbiotica sp. nov., the R-type of secondary endosymbiont of the black bean aphid Aphis fabae. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 61, pp. 2081-2088. https://doi.org/10.1099/ijs.0.024133-0

[46] Bhadra, B., Roy, P., Chakraborty, R. (2005): Serratia ureilytica sp. nov., a novel urea-utilizing species. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 55, pp. 2155-2158. https://doi.org/10.1099/ijs.0.63674-0

[47] Starr, M.P., Grimont, P.A.D., Grimont, F., Starr, P.B. (1976): Caprylate-thallous agar medium for selectively isolating Serratia and its utility in the clinical laboratory. Journal of Clinical Microbiology. 4, pp. 270-276.

[48] BioMérieux (2015): API & ID 32 Identification Databases. https://www.biomerieux-diagnostics.com/sites/clinic/files/9308960-002-gb-b-apiweb-booklet.pdf. Hozzáférés 2020.04.02.

[49] Primerdesign (2019): Serratia marcescens Genesig kit. https://www.genesig.com/products/9405-serratia-marcescens. Hozzáférés 2020.04.02.

[50] Hejazi, A., Keane, C.T., Falkiner, F.R. (1997): The use of RAPD-PCR as a typing method for Serratia marcescens. Journal of Medical Microbiology. 46, pp. 913-919. https://doi.org/10.1099/00222615-46-11-913

[51] Zhu, H., Zhou, W.Y., Xu, M., Shen, Y.L., Wei, D.Z. (2007): Molecular characterization of Serratia marcescens strains by RFLP and sequencing of PCR-amplified 16S rDNA and 16S-23S rDNA intergenic spacer. Letters in Applied Microbiology. 45. pp. 174-178. https://doi.org/10.1111/j.1472-765X.2007.02166.x

[52] Bussalleu, E., Althouse, G.C. (2018): A PCR detection method for discerning Serratia marcescens in extended boar semen. Journal of Microbiological Methods. 151, pp. 106-110. https://doi.org/10.1016/j.mimet.2018.06.012

[53] Zhu, H., Sun, S.J., Dang, H.Y. (2008): PCR detection of Serratia spp. using primers targeting pfs and luxS genes involved in AI-2-dependent quorum sensing. Current Microbiology. 57, pp. 326-330. https://doi.org/10.1007/s00284-008-9197-6

[54] National Center for Biotechnology Information (2020): Search database. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/. Hozzáférés 2020.03.20.

[55] Insightful Science (2020): SnapGene Software. https://www.snapgene.com/. Hozzáférés 2020.03.20.

[56] Machado, S.G., Baglinière, F., Marchand, S., Van Coillie, E., Vanetti, M.C.D., De Block, J., Heyndrick, M. (2017): The biodiversity of the microbiota producing heat-resistant enzymes responsible for spoilage in processed bovine milk and dairy products. Frontiers in Microbiology. 8, p. 302. https://doi.org/10.3389/fmicb.2017.00302

[57] Lafarge, V., Ogier, J.C., Girard, V., Maladen, V., Leveau, J.Y., Gruss, A., Delacroix-Buchet, A. (2004): Raw cow milk bacterial population shifts attributable to refrigeration. Applied and Environmental Microbiology. 70, pp. 5644-5650. https://doi.org/10.1128/AEM.70.9.5644-5650.2004

[58] Ribeiro Jr., J.C., de Oliveira, A.M., de G. Silva, F., Tamanini, R., de Oliveira, A.L.M., Beloti, V. (2018): The main spoilage-related psychrotrophic bacteria in refrigerated raw milk. Journal of Dairy Science. 101, pp. 75-83. https://doi.org/10.3168/jds.2017-13069

[59] Decimo, M., Morandi, S., Silvetti, T., Brasca, M. (2014): Characterization of gram-negative psychrotrophic bacteria isolated from Italian bulk tank milk. Journal of Food Science. 79, pp. 81-90. https://doi.org/10.1111/1750-3841.12645

[60] Baglinière, F., Salgado, R.L., Salgado, C.A., Dantas Vanetti, M.C. (2017): Biochemical characterization of an extracellular heat-stable protease from Serratia liquefaciens isolated from raw milk. Journal of Food Science. 82, pp. 952-959. https://doi.org/10.1111/1750-3841.13660

Tovább a cikk olvasásához


Legfrissebb szám



Támogató és együttműködő partnereink

TÉMAKERESÉS