DOI: https://doi.org/10.52091/EVIK-2022/2-1-HUN

Érkezett: 2022. január – Elfogadva: 2022. március

¹ Élelmiszertudományi és Technológiai Intézet, Magyar Agrár- és Élettudományi Egyetem
² Pécsi Sörfőzde Zrt.
³ Dietetikai és Táplálkozástudományi Tanszék, Semmelweis Egyetem, Egészségtudományi Kar

Kulcsszavak

ízérzékelés, egypontos nukleotid polimorfizmus, bioelektromos impedancia, testtömegindex, élelmiszer preferenciák

2. Bevezetés

A körülöttünk lévő világot, illetve abban önmagunkat érzékszerveinken és érzékeinken keresztül észleljük. Az emberek esetében öt alap érzéket különböztetünk meg: a látást, a hallást, a tapintást, a szaglást és az ízlelést. Ezeken kívül más érzékeket is ismerünk, ide tartozik pl. az egyensúly, az éhség, a szomjúság, a fájdalom vagy a rossz közérzet [1]. Az ízek érzékelése – a szaglással és az általános (trigeminális) kemoszenzoros rendszerrel együtt – a szájhoz és az orrhoz kötődik, és az ún. kémiai érzőfolyamatok közé tartozik, melyek feladata a környezetünkben található vegyületek érzékelése. Az ízek érzékeléséért felelős receptorok az elfogyasztott vegyületeket detektálják, melyeket ízanyagoknak nevezünk. Ezek többnyire vízben oldódó molekulák, melyek a táplálék minőségéről és biztonságosságáról szolgáltatnak információkat [2].

Az ízérzékelés közvetlen kontaktfolyamat, melynek kizárólagos helye a szájüreg. Az érzékelésért felelős receptorok a nyelv felszínén, a garatban, a lágy szájpadon és a nyelőcső felső részén, az ún. ízlelőszemölcsökön elhelyezkedő ízlelőbimbókon találhatóak meg. Az ezek által közvetített információ a VII; IX. és X. agyidegeken, majd az agytörzsi és agyalapi magvakon keresztül a frontális operculum és az insula ízlelőkérgébe érkezik. Ezek a kérgi területek, valamint az agytörzsben a tractus solitarius magvai összeköttetésben állnak a hypothalamussal és az amygdalával, melyek valószínűleg befolyásolják az éhséget és a jóllakottságot (telítettséget), az étkezéssel kapcsolatos egyéb homeosztatikus válaszokat, valamint az étkezéssel kapcsolatos érzelmi reakciókat [2, 3].

A keserű íz gyakran elutasítást vált ki, mely egy veleszületett emberi reakció. Ez az averzív válasz annak köszönhető, hogy számos keserű ízű vegyület (szekunder növényi metabolitok, pl. alkaloidák, egyes szervetlen és szintetikus vegyületek, élelmiszerek esetében pl. az avas zsírok) toxikus, ezek elfogyasztása egészségkárosító, vagy akár életet veszélyeztető is lehet [4]. Ugyanakkor, megannyi olyan keserű ízű vegyület is ismert, mely gyógyszerészeti és táplálkozástudományi szempontból előnyös. Ilyen vegyületek pl. a Brassicaceae családba tartozó káposzta, brokkoli, vagy bimbós kel glükozinolátjai, és ezek bomlástermékei, az izocianátok; a kávé, a tea és a kakaó metilált xantinszármazékai, a koffein, a teofillin és a teobromin; vagy a sörök keserűségét adó komló-eredetű alfa-savak. Míg a zöldségfélék esetében általában elutasítást váltanak ki ezek a vegyületek, az utóbb említett élvezeti termékek esetében a keserű íz kívánt tulajdonság [5, 6, 7].

Az ízek érzékelése során öt alapízt különböztetünk meg: az édeset, a sósat, a savanyút, a keserűt és az umamit. Utóbbi az érzékeléséért felelős receptor felfedezése után, 2002-ben került hivatalosan az alapízek közé [8]. Az öt alapíz közül a keserű íz detektálása a legkomplexebb, ennek szabályozásért a TAS2R géncsalád felelős, mely 25 funkcionális génből áll. Ezek a gének kódolják a TAS2Rs receptorokat, melyek strukturálisan kötődnek egyes keserű ízt kiváltó vegyületekhez (ligandok), azonban számos receptor ligandját még nem sikerült azonosítani [7].

A feniltiokarbamid (PTC, más néven 1-fenil-2-tiourea), illetve a 6-n-propiltiouracil (PROP) színtelen vagy fehér színű, kristályos, keserű ízű szerves vegyületek: mindkettő kéntartalmú (SCN) funkciós csoportot tartalmaz. Kémiai szerkezetüket az 1. ábra mutatja be. Felhasználásuk eltérő: a a feniltiokarbamidot ipari adalékanyagként, színanyagként használják, míg propiltiouracilt antitireoid ágensként alkalmazzák pajzsmirigy-túlműködésben [9, 10].

A két vegyület különlegessége, hogy az emberekben ún. bimodális választ váltanak ki: a populáció egy része képes érzékelni ezek keserű ízét, egy része pedig nem. Ennek felfedezése Arthur Fox vegyész nevéhez fűződik. 1931-ben a DuPont vegyipari vállalat laboratóriumában dolgozó Fox véletlenül a laboratórium légterébe engedett kis mennyiségű finom kristályos PTC-t, mire egy kollégája panaszkodni kezdett annak keserű ízére. Fox ezt annak ellenére nem érezte, hogy közvetlenül érintkezett a porfelhővel. Ez után családját és barátait is tesztelte, mely során „taster” (érző) és „non-taster” (nem érző) státuszba sorolta az egyéneket. Eredményeit még ugyanazon évben alátámasztotta Laurence Hasbrouck Snyder genetikus, aki megállapította, hogy a non-taster státusz a Mendeli genetika szerint egy recesszív jelleg [11].

A kutatáshoz használt PTC lecserélése a rokon vegyületre, a PROP-ra az 1960-as években merült fel először, a PTC erős kénes illata miatt. Az 1980-as években azonban toxikológiai szempontból is kérdésessé vált a PTC, így a kutatók a két vegyület hatásainak összehasonlítása, és a PROP küszöbkoncentrációjának megállapítása után a PROP-ot is használatba vették [12].

Bartoshuk és munkatársai 1991-ben felfedezték, hogy a non-tasterek viszonylag homogén válaszreakciókat adtak, viszont a tasterek reakciói különbözőbbek voltak, egy alcsoportjuk pedig kifejezetten intenzívebbnek érezte a PROP keserű ízét. Az alcsoportba tartozókat „supertastereknek” nevezték el. A supertaster státuszt nem befolyásolja a taster státuszért felelős genotípus, azonban ez a felfedezés magával vonzotta az új klasszifikációs szint, a „medium taster” kifejezés használatát [13].

A taster státuszt a genetikai állomány bizonyos változatai, ebben az esetben egypontos nukleotid polimorfizmusok (Single Nucleotid Polymorphism, SNP) határozzák meg. Az SNP-k a genom egy nukleotidját érintő DNS szekvencia variációk, ugyanahhoz a fajhoz tartozó két egyed genetikai állománya között egyetlen bázis eltérései, ugyanabban a pozícióban. Minden ember genomja egyedi SNP mintázattal rendelkezik, azonban az ilyen változások akkor nevezhetők SNP-nek, ha a populáció legalább 1%-ban megjelennek. Az SNP-k általában a DNS osztódásakor (replikáció) bekövetkező hiba vagy DNS károsodás révén jöhetnek létre. Elhelyezkedhetnek génekben (kódoló és nem kódoló szakaszokban egyaránt), valamint gének között (intergenikusan) is, így okozhatnak szerkezet- és funkcióváltozást is [14].

Az SNP-ket gyűjtő dbSNP adatbázist az amerikai National Center for Biotechnology Information, és a National Human Genome Research Institute közösen hozta létre 1999-ben. A teljes emberi genomot 2003-ban sikeresen feltérképező Human Genome Project ugrásszerűen megnövelte a felfedezett SNP-k számát, mai napig több mint 650 millió egypontos nukleotid variációt térképeztek fel és gyűjtöttek össze az adatbázisban (weblap: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/) [15].

A PTC- és PROP-érzékenység esetében a TAS2R38 keserű íz detektálásáért felelős gén SNP-i határozzák meg, hogy az egyén képes-e a vegyület keserű ízének érzékelésére. A gén egy, hét transzmembrán doménnel rendelkező (heptahelikális) G-protein kapcsolt (Gene Protein Connected Receptor, GPCR) keserűíz-érzékelő receptort kódol, amely a vegyületek N-C=S csoportjához kötődik. Ebben az esetben 1002 nukleotidból álló gén 3 funkcionális missense-coding SNP-t tartalmaz, melyek nem szinonim változásokat eredményeznek, tehát megváltoztatják a kódolt fehérje szerkezetét. A kérdéses fehérje esetében az aminosav-sorrend az 1. táblázatban bemutatottak szerint alakulhat.

A két leggyakoribb haplotípus a PAV, valamit az AVI. A domináns PAV/PAV, vagy PAV/AVI diplotípussal rendelkezők általában taster státuszúak, míg a recesszív AVI/AVI diplotípusúak non-tasterek. Kis gyakorisággal (1-5%), de egyes etnikumok és kisebb populációk esetében előfordulnak AAI, PAI, PVI és AAV haplotípust hordozók is, utóbbi esetében a két státusz nagyjából egyenlő eloszlást mutat. Az eddigi vizsgálatok alapján összességében elmondható, hogy a taster státusz gyakorisága nagyobb, a vizsgált populációtól függően 55-85% [16, 17, 18].

Magyarországon taster státuszt felmérő kutatást 1967-ben, 7-15 éves budapesti gyermekeken végzett Dr. Forrai György gyermekgyógyász és Bánkövi György matematikus. Munkájuk során Harris és Kalmus módszere alapján, PTC oldatokkal meghatározták az ízküszöbértéket az egyes gyermekek esetében, majd ebből következtettek a taster státuszra. Eredményeik alapján a gyermekek 67,8%-a taster státuszú volt, azonban a nem és a státusz között nem találtak szignifikáns összefüggést. Munkájukat az Orvosi Hetilapban publikálták [19].

Anatómiai szempontból a polimorfizmus az ízlelőbimbók számával van összefüggésben: a tasterek több fungiform papillával és ízlelőpórussal rendelkeznek [12].

A PTC és PROP érzékenység más faktorokra gyakorolt hatásának kutatását az 1960-as években kezdték el. A magyarországi születésű pszichofarmakológus-kutató, Roland Fischer volt az első, aki úgy gondolta, összefüggés állhat fenn az ízek érzékelése és az élelmiszerek kedveltsége között [20]. A mai napig számos kutató foglalkozik a taster státusz (és az azt meghatározó haplo- és diplotípusok) és a testtömegindex [17, 21], egyes élelmiszerek kedveltsége és fogyasztási gyakorisága (pl. alkoholos italok [22, 23], zöldségek – különösen a keresztesvirágúak [24, 25], kávé, tea [26], édesítőszerek [27]), valamint egyes megbetegedések (pl. Parkinson kór, gasztrointesztinális daganatok, krónikus rhinosinusitis) és azok tünetei közötti összefüggések felderítésével [28, 29, 30].

3. Célkitűzés

Jelen kutatás célja összefüggések keresése a taster státusz és a testösszetétel, és a különböző keserű ízű élelmiszerek fogyasztási gyakorisága között. Ehhez PTC taster-státusz felmérést, bioimpedancia alapú testösszetétel-meghatározást, valamint egy keserű élelmiszerekre vonatkozó fogyasztási gyakorisági kérdőívet használtunk.

4. Módszer

Az adatfelvételt 2019 februárjában és márciusában végeztük el. A résztvevők a Szent István Egyetem Élelmiszertudományi Karának, valamint a Semmelweis Egyetem Egészségtudományi Karának magyar-országi hallgatói és munkatársai voltak, összesen 170 fő. A taster státusz meghatározásában 170 fő, az testösszetétel-vizsgálatban 96 fő vett részt, az az élelmiszerválasztás gyakorisági kérdőívet (Food Frequency Questionnaire, FFQ) 170 fő töltötte ki. Az adatszolgáltatás minden vizsgálat esetében anonim módon történt. Az egyes adatok összekapcsolásához a résztvevőket kódszámokkal láttuk el. A résztvevőket az általános adatvédelmi rendelet (2016/679 EU rendelet) szerint tájékoztattuk a felvett adatok kezeléséről.

A taster státuszt PTC-vel átitatott papírcsíkokkal határoztuk meg (Precision Europe, Northampton, Egyesült Királyság). A PTC mennyisége csíkonként 20 µg volt. A résztvevőket a papírcsíkok ízlelése után taster és non-taster kategóriákba soroltuk.

A testösszetétel-meghatározást bioelektromos impedancia (BIA) alapú módszerrel, InBody 770 (InBody USA, Cerritos, California) készülékkel végeztük. A módszer az emberi test elektromos tulajdonságain, a különböző szövettípusok vezetőképességén alapul. Egyszerű, noninvazív műszeres módszer, mely igen pontos adatokkal szolgál több antropometriai paraméter, pl. a testzsír százalékos aránya, illetve annak eloszlása esetében is [31]. A felvett adatok közül a testtömegindexet (BMI, kg/m2), a testzsírszázalékot (PBF, %), valamint a viszcerális zsír kiterjedését (VFA, cm²) használtuk fel az elemzésekhez [32, 33, 34].

Az FFQ tartalmaz egy specifikus élelmiszerekből vagy élelmiszertípusokból összeállított listát, melyek esetében a kitöltőknek meg kell jelölniük, milyen gyakran fogyasztják az adott élelmiszert, vagy élelmiszer-típust [35]. A kérdőívet keserű ízű élelmiszereket is tartalmazó élelmiszercsoportokból állítottuk össze, a fogyasztási gyakoriságot kategóriákkal jelöltük. A kérdőívet Google Űrlapok segítségével hoztuk létre, az adatfelvétel online történt. A felvett adatok közül a kávé- és a teafogyasztás adatait közöljük, melyek esetében nem csak a fogyasztási gyakoriságot, hanem fajtát, illetve a leggyakrabban alkalmazott ízesítési módot is meg kellett adniuk a kitöltőknek. Az eredmények átláthatósága érdekében az FFQ gyakorisági kategóriáit három fő kategóriába vontuk össze, melyet a 2. táblázat szemléltet.

5. Statisztikai elemzések

A résztvevők adatainak elemzéséhez leíró statisztikai módszereket (átlag, szórás, százalék), valamint a felvett adatok kategóriaváltozókká való átalakítását követően kereszttábla-elemzést, többszörös korrespondencia-analízist (Multiple Correspondence Analysis, MCA), valamint Mann-Whitney próbát használtunk, 5%-os szignifikanciaszinten [36]. Az elemzésekhez XLSTAT 2020.1.3; Microsoft® Office Excel® 2016 szoftvereket használtunk.

6. Eredmények

6.1. Demográfiai adatok

A kutatásban 55 férfi és 115 nő vett részt, így a nemek megoszlása 32,35 % férfi és 67,65 % nő. Az adatfelvételkor legfiatalabb résztvevő 19, a legidősebb 40 éves, az átlagéletkor pedig 23,85±3,05 év volt. Állandó lakhely szerint 44,70 % budapesti, 55,30 % vidéki lakos. A vidékiek 24,46 %-a pest megyei, ez az összes résztvevő 13,53 %-át teszi ki. Zala és Csongrád-Csanád megyét egy résztvevő sem jelölte meg állandó lakhelyként.

6.1.1. Taster státusz

A taster státusz megoszlása (3. táblázat) szerint a résztvevők 72,94 %-a taster, míg 27,06 %-a non-taster. A non-tasterek aránya a férfiak között 23,63 %, míg a nők között 28,69 % volt. A kereszttábla-elemzés alapján nincs szignifikáns összefüggés a nem és a taster státusz között (χ²(1, n=170)=0,483, p=0,48).

6.1.1.1. A testösszetétel-meghatározás eredményei, és annak összefüggései a taster státusszal

A testösszetétel-meghatározást 23 férfi és 73 nő, összesen 96 fő esetében végeztük el. Az elemzéshez használt adatok átlagait a 4. táblázat tartalmazza.

A férfiak között a BMI alapján 11 fő túlsúlyos (BMI 25,0-29,9) és 3 fő elhízott (BMI > 30,0) volt. A testzsírszázalék-értékek alapján 6 fő volt elhízott (PBF > 27 %), míg a viszcerális zsír kiterjedése 5 fő esetében volt magasabb, mint a 100 cm²-es felső határérték.

A nők között a BMI szerint 5 fő alultáplált (BMI<18,5), 7 fő túlsúlyos, valamint 3 fő elhízott volt. A testzsírszázalék-értékek alapján 18 fő volt elhízott (PBF > 32 %), a viszcerális zsír kiterjedése pedig 15 fő esetében haladta meg a 100 cm²-t.

A statisztikai elemzések alapján nem találtunk szignifikáns összefüggést egyik obezitást jelző paraméter és a taster státusz között sem (BMI: χ²(3, n=96)=0,42, p=0,93; PBF: χ²(1, n=96)=0,45, p=0,50; VFA: χ²(1, n=96)=0,01, p=0,90). A 2. ábrán látható többszörös korrespondenciaelemzés eredményei alapján elmondható, hogy az egyes jelző paraméterek egymással összefüggenek. A 2. ábrán látható mintázat alapján a non-tasterek közelebb helyezkednek el a normál testösszetételt és testtömeget jelző kategóriákhoz. A kereszttábla-elemzés alapján BMI alapján a nőkhöz képest a férfiak esetében szignifikánsan magasabb volt a túlsúlyosak aránya, mint a normál kategóriába tartozóké (χ²(3, n=96)=21,52, p<0,0001).

6.1.1.2. A kávéfogyasztás és a taster státusz összefüggései

Az FFQ-t kitöltők közül 27 ember nem fogyaszt kávét, így az ő adataik az elemzésbe nem kerültek bele. A „Tejjel” kategória a tejjel, tejpótlóval, tejtermékkel való ízesítést, az „Édesítéssel” kategória a bármilyen édesítőszerrel (cukor, mesterséges és természetes édesítőszerek) való fogyasztást jelöli. A „Vegyes” kávéfajta az Arabica és a Robusta felváltva, vagy blend-ként való fogyasztását jelöli. 143 kávéfogyasztó közül 24 feketén (édesítés és tej, vagy tejpótló nélkül) fogyasztja az italt.

A kereszttábla-elemzés alapján nem áll fenn szignifikáns összefüggés a taster státusz és a kávéfogyasztás (χ²(1, n=170)=0,02, p=0,88), a fogyasztási gyakoriság (χ²(1, n=143)=2,57, p=0,10), és a fogyasztott kávéfajta (χ²(3, n=143)=4,21, p=0,24) között. Szintén nem találtunk szignifikáns összefüggést a feketén (χ²(1, n=143)=0,60, p=0,43), tejjel (χ²(1, n=143)=0,28, p=0,59), valamint az édesítve (χ²(1, n=143)=0,17, p=0,67) való fogyasztás, és a taster státusz között. A többszörös korrespondencia analízis mintázata (3. ábra) alapján azonban megfigyelhető, hogy a non-tasterek kevésbé gyakran fogyasztanak kávét, mint a tasterek, és a kávéfajtát sem tudják pontosan megnevezni. Amikor kávét fogyasztanak, édesítik azt. A tasterekhez az Arabica fajta áll a legközelebb, és általában nem édesítik a kávét. A tejjel való ízesítés nem feltétlenül jár együtt az édesítéssel. A nemek szempontjából egyértelmű különbség látszik: a nők között szignifikánsan több volt a kávéfogyasztó (χ2(1, n=143)=3,65, p=0,05), valamint a nők inkább tejjel és édesítve, míg a férfiak tej nélkül, feketén preferálják a kávét. Ezt a kereszttábla elemzés is alátámasztotta (Feketén fogyasztás: χ²(1, n=143)=3,46, p=0,05; Tejjel fogyasztás: χ²(1, n=143)=6,51, p=0,01).

6.1.1.3. A teafogyasztás és a taster-státusz összefüggései

A kitöltők közül 14 fő jelölte, hogy nem fogyaszt teát, így adataikat nem elemeztük. A „Fekete vegyes” kategória több teafajta, köztük fekete tea rendszeres fogyasztását jelenti. A „Zöld vegyes” a fekete teán kívül több más teafajta rendszeres fogyasztását jelenti. Az „Édesítve” kategória a bármilyen édesítőszerrel (cukor, mesterséges és természetes édesítőszerek) való teafogyasztást jelöli. Az „Ízesítés - Vegyesen” kategória az alkalmanként eltérő ízesítést (egyszer édesítve, és/vagy citrommal, egyszer ízesítés nélkül stb.), az „Ízesítés - Mindennel” pedig a cukorral és citrommal való fogyasztást jelöli. 156 teafogyasztó közül 57 fő ízesítés nélkül (édesítőszer, citrom hozzáadása nélkül) fogyasztja az italt.

Elemzéseink során nem találtunk szignifikáns összefüggést a taster státusz és a teafogyasztás (χ²(1, n=170)=1,26, p=0,26), annak gyakorisága (χ²(1, n=156)=0,95, p=0,32), a fogyasztott teafajták (χ²(5, n=156)=2,57, p=0,76) és az ital ízesítési módjai (χ²(4, n=156)=5,13, p=0,27) között. A nemek esetében szintén nem találtunk szignifikáns összefüggést.

A többszörös korrespondencia-analízis ábráján (4. ábra) látható mintázat alapján a nők és a taster-ek gyakrabban fogyasztanak teát, azon belül is fekete- és gyógynövényteákat, ízesítés nélkül, vagy édesítve. A férfiak és a non-taster-ek ritkábban fogyasztanak teát, valamint a zöld teákat részesítik előnyben, citrommal ízesítve és édesítve, vagy csak citrommal. Kizárólag gyümölcstea fogyasztása, illetve alkalmanként eltérő ízesítés alkalmazása a kitöltők körében nem jellemző.

7. Megbeszélés

A taster és non-taster kategóriák arányai megegyeznek a nemzetközi szakirodalomban közölt adatokkal, melyek szerint amerikai és kaukázusi populációban 70 % / 30 % az eloszlás [6, 37].

A taster státusz és a BMI között nem találtunk szignifikáns összefüggést, hasonlóan korábbi kutatásokhoz [17, 38]. Ezzel szemben más kutatók kimutattak szignifikáns összefüggéseket a paraméterek között [39]. A szakirodalmi adatok ez alapján ellentmondásosak, nincs konszenzus a kutatók között. Új eredményeink alapján nem találtunk összefüggést a taster státusz és a testzsírszázalék, a viszcerális zsír kiterjedése között sem.

Vizsgálataink során a túlsúlyos BMI kategórián belül szignifikáns különbséget találtunk a két nem között. Ennek oka a két nem eltérő izomtömege: a BMI nem tesz különbséget a zsírszövet és a zsírmentes szövetek között, valamint nem kalkulál a testzsír eloszlásával sem, így, bár specifitása nagy, érzékenysége alacsonynak tekinthető [40]. A résztvevő férfiak esetében a vázizomtömeg szignifikánsan magasabb volt (Mann–Whitney U=1664, n₁ =23, n₂ = 73, p<0,0001, kétoldalú), így közülük többen kerültek a túlsúlyos kategóriába.

Noha a kávéfogyasztás esetében nem találtunk szignifikáns összefüggéseket, a többszörös korrespondenciaelemzés alapján azonban tendenciák figyelhetőek meg. A non-tasterek kevésbé gyakran fogyasztanak kávét, és nem is tudják megnevezni a fogyasztott kávé fajtáját. Ezek valószínűleg összefüggenek egymással, hiszen a kávéfogyasztás iránt kevésbé érdeklődők a kávé fajtája iránt is kisebb érdeklődést mutathatnak. Amikor kávét fogyasztanak, édesítik azt, ez a tasterek esetében kevésbé jellemző, melyet szakirodalmi adatok is alátámasztanak [41]. A nemek esetében a kávé eltérő ízesítéssel, illetve ízesítés nélkül („Feketén”) való preferálása esetleg egy-egy társadalmi elvárásból fakadó magatartásnak tulajdonítható, mely szerint a rövid eszpresszó kávé (espresso shot) fogyasztása férfiasabb, míg a tejjel-édesítéssel készült kávéitaloké (pl. milk espresso) nőiesebb [42].

A teafogyasztás esetében sem találtunk szignifikáns összefüggéseket, azonban tendenciózus eredményeink összhangban vannak a nemzetközi szakirodalommal, miszerint a tasterek kevésbé preferálják a zöld teákat [43, 44].

A kutatás limitációja, hogy demográfiai szempontból nem volt reprezentatív. A vizsgálatok során kereskedelmi forgalomban kapható tesztcsíkokkal dolgoztunk, melyeknél pontosabb eredményekkel szolgálhatnak PTC vagy PROP oldatsorokkal végzett tesztek.

8. Következtetés

A szakirodalmi adatok, és saját eredményeink alapján nem zárható ki, hogy összefüggés áll fenn a genotípus és a testösszetétel, valamint az élelmiszerválasztás között. Valószínűleg azonban nem a genotípus, hanem a fenotípus (taster – non-taster) az, ami közvetetten, a preferenciákon és az élelmiszerválasztáson keresztül hozzájárulhat az elhízáshoz, és az ahhoz köthető betegségek kialakulásához. Mivel azonban az étkezési szokásokat és az élelmiszerpreferenciákat más, pl. szociodemográfiai és pszichológiai faktorok is befolyásolják, ezek hatása felülírhatja a fenotípus alapján „törvényszerűnek” vélt következményeket (keserű íz kedvelése/kerülése). További, nagymintás, reprezentatív kutatások eredményei szükségesek a feltételezések igazolásához.

9. Nyilatkozatok

Anyagi támogatás: A projekt az EFOP-3.6.3-VEKOP-16-2017-00005 számú pályázat támogatásával készült. Az Innovációs és Technológiai Minisztérium ÚNKP-19-3-I-SZIE-65 kódszámú Új Nemzeti Kiválóság Programjának szakmai támogatásával készült. A szerzők köszönik a Nemzeti Kutatási, Fejlesztési és Innovációs Hivatal támogatását (FK 137577).

Szerzői munkamegosztás: Kísérlettervezés: BB, LA, VBM, GA; Adatgyűjtés: BB, KD, LA, VBM, KZ; Adatelemzés: BB, GA; Kézirat elkészítése: BB, GA, KZ; Kézirat felülvizsgálata, jóváhagyása: BB, GA, KD, LA, VBM, KZ.

Érdekeltségek: A szerzőknek nincsenek érdekeltségeik.

Köszönetnyilvánítás: Biró Barbara köszöni a Magyar Agrár- és Élettudományi Egyetem Élelmiszertudományi Doktori Iskola támogatását. Gere Attila köszöni a Prémium Posztdoktori Program és az NKFIH K134260 számú projektjének támogatását. A szerzők köszönik a kutatásban részt vevők közreműködését.

10. Irodalom

[1] Miller-Keane, O’Toole M. (2003): Miller-Keane Encyclopedia & Dictionary of Medicine, Nursing & Allied Health, 7th ed. Saunders, Philadelphia.

[2] Purves D; Augustine G. J; Fitzpatrick D; et al. (2004): Neuroscience, 3rd ed. Sinauer Associates, Sunderland.

[3] Gottfried J. A. (2011): Neurobiology of Sensation and Reward, 1st ed. CRC Press, Boca Raton. DOI

[4] Meyerhof W; Behrens M; Brockhoff A; et al. (2005): Human bitter taste perception. Chemical Senses, 30 (Suppl 1) pp. 14-15. DOI

[5] Wieczorek M. N; Walczak M; Skrzypczak-Zielińska M; et al. (2017): Bitter taste of Brassica vegetables: the role of genetic factors, receptors, isothiocyanates, glucosinolates and flavor context. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 58 (18) pp. 3130-3140. DOI

[6] Tepper B. J. (2008): Nutritional Implications of Genetic Taste Variation: The Role of PROP Sensitivity and Other Taste Phenotypes. Annual Review of Nutrition, 28 pp. 367-388. DOI

[7] Beckett E. L; Martin C; Yates Z; et al. (2014): Bitter taste genetics - the relationship to tasting, liking, consumption and health. Food and Function, 5 (12) pp. 3040-3054. DOI

[8] Kurihara K. (2009): Glutamate: From discovery as a food flavor to role as a basic taste (umami). American Journal of Clinical Nutrition, 90 (3) pp. 1-3. DOI

[9] National Center for Biotechnology Information, PubChem Database. Phenylthiourea, CID=676454. (Hozzáférés: 2020. 05. 20.)

[10] National Center for Biotechnology Information, PubChem Database. Propylthiouracil, CID=657298. (Hozzáférés: 2020. 05. 20.)

[11] Trivedi B. P. (2012): The finer points of taste. Nature, 486 S2-S3. DOI

[12] Bartoshuk L. M; Duffy V. B; Miller I. J. (1994): PTC/PROP Tasting: Anatomy, Psychophysics, and Sex Effects. Physiology and Behavior, 56 (6) pp. 1165-1171. DOI

[13] Hayes J. E; Keast R. S. J. (2011): Two decades of supertasting: Where do we stand? Physiology and Behavior, 104 (5) pp. 1072-1074. DOI

[14] Brookes A. J. (1999): The essence of SNPs. Gene, 234 (2) pp. 177-186. DOI

[15] National Center for Biotechnology Information and U.S. National Library of Medicine Database of Single Nucleotide Polymorphisms (dbSNP). (Hozzáférés: 2020. 05. 20.)

[16] Kim U. K; Drayna D. (2005): Genetics of individual differences in bitter taste perception: Lessons from the PTC gene. Clinical Genetics, 67 (4) pp. 275-280. DOI

[17] Deshaware S; Singhal R. (2017): Genetic variation in bitter taste receptor gene TAS2R38, PROP taster status and their association with body mass index and food preferences in Indian population. Gene, 627 pp. 363-368. DOI

[18] Campbell M. C; Ranciaro A; Froment A; et al. (2012): Evolution of functionally diverse alleles associated with PTC bitter taste sensitivity in Africa. Molecular Biology and Evolution, 29 (4) pp. 1141-1153. DOI

[19] Forrai Gy; Bánkövi Gy. (1967): Phenylthiocarbamid-ízlelőképesség vizsgálata budapesti gyermekpopulációban. Orvosi Hetilap, 108 (36) pp. 1681-1687. DOI

[20] Fischer R; Griffin F; England S; et al. (1961): Taste Thresholds and Food Dislikes. Nature, 191 pp. 1328. DOI

[21] Carta G; Melis M; Pintus S; et al. (2017): Participants with Normal Weight or with Obesity Show Different Relationships of 6-n-Propylthiouracil (PROP) Taster Status with BMI and Plasma Endocannabinoids. Scientific Reports, 7 (1) pp. 1-12. DOI

[22] Choi J. H; Lee J; Yang S; et al. (2017): Genetic variations in taste perception modify alcohol drinking behavior in Koreans. Appetite, 113 pp. 178-186. DOI

[23] Yang Q; Dorado R; Chaya C; et al. (2018): The impact of PROP and thermal taster status on the emotional response to beer. Food Quality and Preference, 68 pp. 420-430. DOI

[24] Shen Y; Kennedy O. B; Methven L. (2016): Exploring the effects of genotypical and phenotypical variations in bitter taste sensitivity on perception, liking and intake of brassica vegetables in the UK. Food Quality and Preference, 50 pp. 71-81. DOI

[25] Mezzavilla M; Notarangelo M; Concas M. P; et al. (2018): Investigation of the link between PROP taste perception and vegetables consumption using FAOSTAT data. International Journal of Food Sciences and Nutrition, 70 (4) pp. 484-490. DOI

[26] De Toffoli A; Spinelli S; Monteleone E; et al. (2019): Influences of Psychological Traits and PROP Taster Status on Familiarity with and Choice of Phenol-Rich Foods and Beverages. Nutrients, 11 (6) pp. 1329. DOI

[27] Yang Q; Kraft M; Shen Y; et al. (2019): Sweet Liking Status and PROP Taster Status impact emotional response to sweetened beverage. Food Quality Preference, 75 pp. 133-144. DOI

[28] Cossu G; Melis M; Sarchioto M; et al. (2018): 6-n-propylthiouracil taste disruption and TAS2R38 nontasting form in Parkinson’s disease. Movement Disorders, 33 (8) pp. 1331-1339. DOI

[29] Choi J; Kim J. (2019): TAS2R38 Bitterness Receptor Genetic Variation and Risk of Gastrointestinal Neoplasm: A Meta-Analysis. Nutrition and Cancer - An International Journal, 71 (4) pp. 585-593. DOI

[30] Dżaman K; Zagor M; Sarnowska E; et al. (2016): The correlation of TAS2R38 gene variants with higher risk for chronic rhinosinusitis in Polish patients. Otolaryngologia Polska - The Polish Otolaryngology, 70 (5) pp. 13-18. DOI

[31] Dubiel A. (2019): Bioelectrical impedance analysis in medicine. World Scientific News, 125 pp. 127-138.

[32] WHO (2000): Obesity: Preventing and managing the global epidemic. WHO Technical Report Series 894, Geneva.

[33] American Council on Exercise (2020): Percent Body Fat Norms for Men and Women. ACE - Tools & Calculators. Hozzáférés: 2020. 06. 18.

[34] InBody USA. InBody 770 Result Sheet Interpretation. (Hozzáférés: 2020. 06. 18.)

[35] Welch A. A. (2013): Dietary intake measurement: Methodology. In: Caballero B. (ed.): Encyclopedia of Human Nutrition, 3rd ed; vol. 2. Academic Press, Oxford, pp. 65-73. DOI

[36] Greenacre M. (2017): Correspondence Analysis in Practice, 3rd ed. Chapman and Hall/CRC, New York. DOI

[37] Tepper B. J. (1999): Does genetic taste sensitivity to PROP influence food preferences and body weight? Appetite, 32 (3) pp. 422. DOI

[38] Yackinous C. A; Guinard J. (2002): Relation between PROP (6-n-propylthiouracil) taster status, taste anatomy and dietary intake measures for young men and women. Appetite, 38 (3) pp. 201-209. DOI

[39] Choi S. E; Chan J. (2015): Relationship of 6-n-propylthiouracil taste intensity and chili pepper use with body mass index, energy intake, and fat intake within an ethnically diverse population. Journal of the Academy of Nutrition and Dietetics, 115 (3) pp. 389-396. DOI

[40] Adab P; Pallan M; Whincup P. H. (2018): Is BMI the best measure of obesity? BMJ, 360 pp. 15-16. DOI

[41] Masi C; Dinnella C; Monteleone E; et al. (2015): The impact of individual variations in taste sensitivity on coffee perceptions and preferences. Physiology and Behavior, 138 pp. 219-226. DOI

[42] Reitz J. K. (2007): Espresso. Food, Culture and Sociology, 10 (1) pp. 7-21. DOI

[43] Chamoun E; Mutch D. M, Allen-Vercoe E; et al. (2018): A review of the associations between single nucleotide polymorphisms in taste receptors, eating behaviors, and health. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 58 (2) pp. 194-207. DOI

[44] Pasquet P; Oberti B; El Ati J; et al. (2002): Relationships between threshold-based PROP sensitivity and food preferences of Tunisians. Appetite, 39 (2) pp. 167-173. DOI

DOI: https://doi.org/10.52091/EVIK-2022/2-3-HUN

Érkezett: 2021. október - Elfogadva: 2022. március

¹ Széchenyi István Egyetem, Agrártudományi és Élelmiszertudományi Kar, Víz- és Környezettudományi tanszék
² SISAF Nanotechnology Drug Delivery, Ulster University
^* Levelező szerző: Széchenyi István Egyetem, Agrártudományi és Élelmiszertudományi Kar, Víz- és Környezettudományi tanszék

Kulcsszavak

Kwashiorkor, egysejtes fehérje, élelmiszer-melléktermékek, takarmányozás, fermentáció, biotechnológia

2. Bevezetés

A régebbi évtizedekben a különböző élelmiszeripari hulladékokat különféle vegyszerekkel kezelték, amely nem volt a legjobbnak tekinthető hulladékkezelési megoldás. Ahogy a világ népessége növekszik, az elmúlt évtizedekben az állat- és tejtermelés is folyamatosan növekszik. A világ jelenleg több mint 350 millió tonna állati eredetű fehérjét termel, és ez az érték 2050-re várhatóan 1250 millió tonnára fog emelkedni, hogy kielégítse az állati eredetű fehérje iránti globális keresletet [1]. Manapság sok cég alakít át a különféle hulladékokat hasznos élelmiszerekké, élelmiszer-összetevőkké vagy takarmánytermékekké emberi táplálkozásra és az állatok takarmányozása céljából. Ezek a termékek környezetbarátnak és egészségügyi szempontból is kedvezőknek tekinthetők, mint például a biogáz, a bioüzemanyagok és az egyéb bioenergiák. A rendelkezésre álló módszerek és technikák lehetőséget adnak arra, hogy ezeket a termékeket egysejt-olajokként, egysejt-fehérjékként, vegyi anyagokként, enzimekként és sok más hasznos anyaggá alakítsuk át.

A szénhidrátok és a zsírok után a fehérjék a legfontosabb makrotápanyagok, amelyekre a szervezetnek nagy mennyiségben szüksége van. Fogyasztásuk elengedhetetlen tényező a növekedéshez, a test helyreállításához és az egészség megőrzéséhez. Valamennyi fehérje 20 aminosavból áll, és ezek határozzák meg a fehérje tápértékét. Az aminosavak egy részét az ember nem tudja szintetizálni, de mégis esszenciálisak (valin, leucin, izoleucin, fenilalanin, triptofán, lizin, hisztidin, metionin és treonin), és ezeket étrendünkből kell bevinni. Az aminosavak általános szerkezetét az 1. ábra mutatja be.

A fehérjék emésztése a gyomorban kezdődik és a bél lumenében folytatódik, ahol a fehérjék mono- és diaminosavakká bomlanak le. Ezeket az aminosavakat a belekben specifikus transzporterek kötik meg, majd a vérbe juttatják, hogy a szervezet egyéb szöveteinek nitrogénalapú vázát képezhessék. Ezek között neurotranszmitterek, enzimek és hormonok is vannak [2, 3]. Bár mind a növényi, mind az állati fehérjék összetevőikben hasonlóak, mindkettő fehérjecsoport közel ugyanazokat az aminosavakat tartalmazza, de az összes esszenciális aminosavat az állati fehérjék tartalmazzák [4].

Általánosságban elmondható, hogy az emberi szervezetnek testtömeg-kilogrammonként 1,0-1,5 g fehérjére van szüksége úgy a felnőttek, mint a gyermekek esetében [5]. Ha az étrend hosszú ideig fehérjehiányos, a kwashiorkor nevű betegséget okozhatja, amely az alultápláltság súlyos formája [6].

Az egysejt-fehérje (SCP) a hulladékokból származó egyik kiváló minőségű és értékes diétás termék [8, 9, 10, 11, 12]. Az SCP egy biomassza, amelyet különböző mikroorganizmusok állítanak elő, így bioproteinnek, mikrobiális fehérjének vagy biomasszának is nevezhetjük. Ezek a mikroorganizmusok fehérjében gazdag összetevőként emberi táplálékban és állati takarmányban is felhasználhatók [8]. Ezen túlmenően az SCP-k növényi fehérjeforrások hasznos alternatívája lehet, egész évben előállíthatók és nem bocsátanak ki üvegházhatású gázokat. A fehérje előállításához legfontosabb az olcsó és megfelelő szubsztrátok vagy agráripari melléktermékek és értékes mikroorganizmusok kiválasztása az egysejt-fehérjék előállítási költségének csökkentéséhez [8, 13, 14, 15, 16, 17]. Ennek elérése érdekében különféle szubsztrátumokat használtak, mint például almatörköly, jamsz-héj (Dioscorea sp. Szerk), citruspép, burgonya héja, ananászhulladék, papayahulladék [8]. A leggyakrabban használt melléktermékek azonban a melasz és a kukoricaáztató lé. A mikroorganizmusok kutatási és ipari célokra való helyes kiválasztása is fontos.

Dolgozatunk a mikroorganizmusok (algák, élesztő, baktériumok) által termelt egysejt-fehérjékre, mint alternatív fehérjeforrásokra összpontosít. Az erjesztéssel előállított egysejt-fehérje kedvező beltartalmi értékeinek köszönhetően (fehérjék, vitaminok, ásványi anyagok) jól emészthető formában felhasználható emberi táplálkozásra, mint élelmiszer. Vitamin-kiegészítéssel különösen, mint funkcionális élelmiszer-összetevő, hozzájárul az alultápláltság megelőzéséhez, kezeléséhez is [10].

3. Anyag és módszer

Az áttekintő dolgozat elkészítéséhez elektronikus kereséseket végeztünk a Google Scholar adatbázison, a Medline-on és a PubMed-en. További keresést végeztünk az interneten is. A keresési elemek a következők voltak: táplálkozás, étrend, fehérje, egysejt-fehérje, immunrendszer. Ezt az áttekintést a legújabb irodalom elemzésére végeztük, abból a célból, hogy bemutassuk a táplálkozási szokások és az egysejt-fehérjék étrendi hatását.

4. Eredmények

4.1. Egysejt-fehérjék előállítása fermentációval

Az egysejt-fehérje (SCP) egy, termesztett mikrobiális biomasszából származó fehérje, amely az étrendben fehérje-kiegészítésre használható. Az SCP fermentációs folyamata a 2. ábrán látható. Az SCP-k előállításához mezőgazdasági és ipari hulladékok szolgálnak szubsztrátként. Az algák, gombák és baktériumok a mikrobiális fehérje fő forrásai, amelyek SCP-ként hasznosíthatók (1. táblázat) [18]. A fajok élelmiszerként való felhasználhatósága függ a növekedési sebességtől, a felhasznált szubsztráttól, annak szennyeződéseitől, toxintartalmától. Az előállított biomassza fehérjében, aminosavakban, például lizinben és metioninban, telítetlen zsírsavakban, vitaminokban és ásványi anyagokban gazdag. Az ilyen biomasszát élelmiszerként, étrend-kiegészítőként [18] és takarmányként világszerte használják.

4.2. Élelmiszer melléktermékek, főként melasz és kukoricaáztató lé felhasználása biomassza előállítására

A termelési költségek csökkentésének, az élelmiszerrendszer kapacitásának növelése és a környezeti fenntarthatósági kampányhoz való csatlakozás fontos feltétele az élelmiszer-veszteség és -pazarlás csökkentése. Az élelmiszer-hulladék számos biológiailag lebomló komponenst tartalmaz a kórokozó mikroorganizmusok számára, amelyek fertőző betegségeket okozhatnak. Így az élelmiszer-veszteség és a hulladékcsökkentés szintén kedvező hatással van a fogyasztók egészségére és jólétére.

Az Európai Unió ennek szellemében is támogatja az élelmiszer-pazarlás csökkentését, amelyek zöldségekből, gyümölcsökből, italokból, cukorból, húsból, akvakultúrából és tenger gyümölcseiből származó élelmiszer-melléktermékek funkcionális vagy bioaktív összetevőit is tartalmazzák. Az élelmiszer-melléktermékek felhasználhatók a táplálék- vagy gyógyszeriparban. Ezek fermentációs biotechnológiával állati takarmánytermékekké alakíthatók [30]. Az egyik leggyakrabban használt élelmiszer-melléktermék a melasz és a kukoricapehely. A melasz (M) a cukornád mellékterméke, és számos fermentációs vegyületet tartalmaz, például vitaminokat, ásványi anyagokat, szacharózt és szerves vegyületeket. Ezenkívül a kukorica áztatólúg (CSL) a kukorica nedves őrlési iparának mellékterméke, és számos összetevőben gazdag, például vitaminokban, ásványi anyagokban, aminosavakban és fehérjékben. Ezenkívül a CSL fontos nitrogénforrás is [31]. A fermentációs folyamatban szubsztrátként használt melasszal és kukoricaáztató lével kapcsolatos irodalmi adatokat a 2. táblázatban foglaltuk össze.

4.3. A fermentációval előállított egysejt-fehérje szerepe az állati takarmányozásban

A jó minőségű és magas fehérjében gazdag emberi élelmiszerek és állati takarmányok, amelyeket fontos növelni a globális népesség növekedésével. A mikrobiális biomasszán alapuló, egysejtű fehérje (SCP) termékek potenciális összetevője ennek az igénynek [42]. Az SCP kiváló minőségű omega-3 zsírsavakat, vitaminokat, mikrotápanyagokat, fehérjét és egyéb, az állati szervezet számára hasznos összetevőket tartalmaz. Ezeket az értékes összetevőket a 3. táblázatban foglaltuk össze.

Az egysejt-fehérjék az állati takarmányban kedvezően egészítik ki a fehérjeszükségletet a hagyományos takarmányok mellett. Ez az állati eredetű termékek minőségét is befolyásolhatja. Az egysejt-fehérjék állati takarmányban betöltött szerepét számos kézirat igazolja, melyeket a 4. táblázat mutat be.

7. Irodalom

[1] Ritala A., Häkkinen Suvi T., Toivari M., Wiebe Marilyn G. (2017) Single Cell Protein State of the Art, Industrial Landscape and Patents 2001–2016. Frontiers in Microbiology. 8:1-18. DOI

[2] Dallas D. C., Sanctuary M. R., Qu Y., Khajavi S. H., Van Zandt A. E., Dyandra M., Frese S. A., Barile D., Germal J. B. (2017): Personalizing protein nourishment. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 57(15):3313-3331. DOI

[3] Berg J. M., Tymoczko J. L., Stryer L. (2002): Biochemistry. 5th edition. New York: W H Freeman Section 23.1, Proteins Are Degraded to Amino Acids.

[4] Lopez M. J, Mohiuddin S. S. (2021): Biochemistry, Essential Amino Acids. [Updated 2021 Mar 26]. In: StatPearls [Internet]. Treasure Island (FL)

[5] Delimaris I. (2013): Adverse Effects Associated with Protein Intake above the Recommended Dietary Allowance for Adults. ISRN Nutrition. 2013:1-6. DOI

[6] Benjamin O, Lappin S. L. (2021): Kwashiorkor. Treasure Island (FL): Stat Pearls Publishing, 2021 Jan.

[7] Ahmed M., Ahmed W., Byrne J. (2013): Adsorption of Amino Acids Onto Diamond for Biomedical Applications: Deposition, Characterization and the Adsorption Behaviour of Amino Acids on Doped Diamond. KS Omniscriptum Publishing.296. ISBN: 365947360X, 9783659473609

[8] Sharif M., Zafar M. H., Aqid A. I., Saeed M., Farag M. R., Alagawany M. (2021): Single cell protein: Sources, mechanism of production, nutritional value and its uses in aquaculture nutrition. Aquaculture.531:1-8. DOI

[9] Spalvins K., Zihare L., Blumberga D. (2018): Single cell protein production from waste biomass: comparison of various industrial by-products. Energy Procedia. 147:409-418. DOI

[10] Reihani S. F. S., Khosravi-Darani K. (2019): Influencing factors on single-cell protein production by submerged fermentation: A review. Electronic Journal of Biotechnology. 37:34-40. DOI

[11] Baidhe E., Kigozi J., Mukisa I., Muyanja C., Namubiru L., Kitarikawe B. (2021): Unearthing the potential of solid waste generated along the pineapple drying process line in Uganda: A review. Environmental Challenges. 2:1-11. DOI

[12] Allegue L. D., Puyol D., Melero J. A. (2020): Novel approach for the treatment of the organic fraction of municipal solid waste: Coupling thermal hydrolysis with anaerobic digestion and photo-fermentation. Science of the Total Environment. 714. pp. 1-10. DOI

[13] Buitrago Mora H. M., Pineros M. A., Espinosa Moreno D., Restrepo Restrepo S., Jaramillo Cardona J. E. C., Álvarez Salano Ó. A., Fernandez-Nino M., González Barrios A. F. (2019): Multiscale design of a dairy beverage model composed of Candida utilis single cell protein supplemented with oleic acid. Journal of Dairy Science. 102. pp. 9749-9762. DOI

[14] Lo C.-A., Chen B. E. (2019): Parental allele-specific protein expression in single cells In vivo. Developmental Biology. 454:66-73. DOI

[15] Mahmoud M. M., Kosikowski F. V. (1982): Alcohol and single Cell Protein Production by Kluyveromyces in Concentrated Whey Permeates with Reduced Ash. Journal of Dairy Science. 65. pp. 2082-2087. DOI

[16] Daghir N. J., Sell J. L. (1981): Amino Acid Limitations of Yeast Single-Cell Protein for Growing Chickens. Poultry Science. 61. pp. 337-344. DOI

[17] El-Samragy Y. A., Zall R. R. (1987): The Influence of Sodium Chloride on the Activity of Yeast in the Production of Single Cell Protein in Whey Permeate. Journal of Dairy Science. 71. pp. 1135-1140. DOI

[18] Anupama, Ravindra P. (2000): Value-added food: Single cell protein. Biotechnology Advances.18. pp. 459-479. DOI

[19] Patelski P., Berlowska J., Dziugan P., Pielechprzybylska K., Balcerek M., Dziekonska U., Kalinowska H. (2015): Utilisation of sugar beet bagasse for the biosynthesis of yeast SCP. Journal of Food Engineering. 167. pp. 32-37. DOI

[20] Lee B., Kim J. K. (2001): Production of Candida utilis biomass on molasses in different culture types. Aquacultural Engineering. 25. pp. 111-124. DOI

[21] Kim J. K., Tak K., Moon J. (1998): A continuous fermentation of Kluyveromyces fragilis for the production of a highly nutritious protein diet. Aquacultural Engineering. 18. pp. 41-49. DOI

[22] Coca M., Barrocal V. M., Lucas S., Gonzálezbenito G., García-Cubero M. T. (2015): Protein production in Spirulina platensis biomass using beet vinasse-supplemented culture media. Food and Bioproducts Processing. 94. pp. 306-312. DOI

[23] Hanh V., Kim K. (2009): High-Cell-Density Fed-Batch Culture of Saccharomyces cerevisiae KV-25 Using Molasses and Corn Steep Liquor. Journal of Microbiology and biotechnology.19. pp. 1603-1611. DOI: DOI

[24] Zepka L. Q., Jacob-Lopes E., Goldbeck R., Souzasoares L. A., Queiroz M. I. (2010): Nutritional evaluation of single-cell protein produced by Aphanothece microscopica Nägeli. Bioresource Technology. 101. pp. 7107-7111. DOI: DOI

[25] Rajoka M. I., Khan S. H., Jabbar M. A., Awan M. S., Hashmi A. S. (2006): Kinetics of batch single cell protein production from rice polishings with Candida utilis in continuously aerated tank reactors. Bioresource Technology. 97. pp. 1934-1941. DOI: DOI

[26] Yadav J. S. S., Bezawada J., Ajila C. M., Yan S., Tyagi R. D., Surampalli R. Y. (2014): Mixed culture of Kluyveromyces marxianus and Candida krusei for single-cell protein production and organic load removal from whey. Bioresource Technology. 164. pp. 119-127. DOI

[27] De Gregorio, A., Mandalari, G., Arena, N., Nucita, F., Tripodo, M. M., Lo Curto, R. B. (2002): SCP and crude pectinase production by slurry-state fermentation of lemon pulps. Bioresource Technology. 83. pp. 89-94. DOI

[28] Lo Curto, R. B., Tripodo M. M. (2001): Yeast production from virgin grape marc. Bioresource Technology. 78. pp. 5-9. DOI

[29] Fontana J. D., Czeczuga B., Bonfim T. M. B., Chociai M. B., Oliveira B. H., Guimaraes M. F., Baron M. (1996): Bioproduction of carotenoids: the comparative use of raw sugarcane juice and depolymerized bagasse by Phaffia Rhodozyma. Bioresource Technology. 58. pp. 121-125. DOI

[30] Socas-Rodríguez B., Álvarez-Rivera G., Valdés A., Ibánez E. (2021): Food by-products and food wastes: are they safe enough for their valorization? Trends in Food Science & Technology. 114. pp. 133-147. DOI

[31] Amado I. R., Vázquez J. A., Pastrana L., Teixeira J. A. (2017): Microbial production of hyaluronic acid from agro-industrial by-products: Molasses and corn steep liquor. Biochemical Engineering Journal. 117. pp. 181-187. DOI

[32] Palmonari A., Cavallini D., Sniffen C. J., Fernandes L., Holder P., Fagioli L., Fusaro I., Biagi G., Formigoni A., Mammi L. (2020): Short communication: Characterization of molasses chemical composition. Journal of Dairy Science. 103. pp. 6244-6249. DOI

[33] Wang J., Chen L., Yuan X.-J., Guo G., Li J.-F., Bai Y.-F., Shao T. (2017): Effects of molasses on the fermentation characteristics of mixed silage prepared with rice straw, local vegetable by-products and alfalfa in Southeast China. Journal of Integrative Agriculture. 16. pp. 664-670. DOI

[34] Sarka E., Bubnik Z., Hinkova A., Gebler J., Kadlec P. (2012): Molasses as a by-product of sugar crystallization and a perspective raw material. Procedia Engineering. 42. pp. 1219-1228. DOI

[35] Chooyok P., Pumijumnog N., Ussawarujikulchai A. (2013): The Water Footprint Assessment of Ethanol Production from Molasses in Kanchanaburi and Supanburi Province of Thailand. APCBEE Procedia. 5. pp. 283-287. DOI

[36] Siverson A., Vargas-Rodriguez C. F., Bradford B. J. (2014): Short communication: Effects of molasses products on productivity and milk fatty acid profile of cows fed diets high in dried distillers grains with solubles. Journal of dairy Science. 97. pp. 3860-3865. DOI

[37] Karigidi K. O., Olaiya C. O. (2020): Antidiabetic activity of corn steep liquor extract of Curculigo pilosa and its solvent fractions in streptozotocin-induced diabetic rats. Journal of Traditional and Complementery Medicine. 10. pp. 555-564. DOI

[38] Li X., Xu W., Yang J., Zhao H., Xin H., Zhang Y. (2016): Effect of different levels of corn steep liquor addition on fermentation characteristics and aerobic stability of fresh rice straw silage. Animal Nutrition. 2. pp. 345-350. DOI

[39] Waldroup P. W., Hazen K. R. (1979): Examination of Corn Dried Steep Liquor Concentrate and Various Feed Additives as Potential Sources of a Haugh Unit Improvement Factor for Laying Hens. Poultry Science. 58. pp. 580-586. DOI

[40] Kennedy H. E., Speck M. L. (1955): Studies on Corn Steep Liquor in the Nutrition of Certain Lactic Acid Bacteria. Journal of Dairy Science. 38. DOI

[41] Cardinal B. E. V., Hedrick L. R. (1948): Microbiological assay of corn steep liquor for amino acid content. Journal of Biological Chemistry. pp. 609-612. (https://www.jbc.org/article/S0021-9258(19)52747-8/pdf)">DOI

[42] Jones S. W., Karpol A., Friedman S., Maru B. T., Tracy B. P. (2020): Recent advances in single cell protein use as a feed ingredient in aquaculture. Current opinion in Biotechnology. 61. pp. 189-197. DOI

[43] Yang P., Li X., Song B., He M., Wu C., Leng X. (2021): The potential of Clostridium autoethanogenum, a new single cell protein, in substituting fish meal in the diet of largemouth bass (Micropterus salmoides): Growth, feed utilization and intestinal histology. Aquaculture and Fisheries. pp. 1-9. DOI

[44] Claypool D. W., Church D. C. (1984): Single Cell Protein from Wood Pulp Waste as a Feed Supplement for Lactating Cows. Journal of Dairy Science. 67:216-218. DOI

[45] Waldroup P. W., Payne J. R. (1974): Feeding Value of Methanol-Derived Single Cell Protein for Broiler Chicks. Poultry Science. 53:1039-1042. DOI: DOI

[46] Olsen M. A., Vhile S. G., Porcellato D., Kidane A., Skeie S. B. (2021): Feeding concentrates with different protein sources to high-yielding, mid-lactation Norwegian Red cows: Effect on cheese ripening. Journal of Dairy Science. 104: 4062-4073. DOI

[47] Jin S.-E., Lee S. J., Kim Y., Park C.-Y. (2020): Spirulina powder as a feed supplement to enhance abalone growth. Aquaculture Reports. 17:1-8. DOI

DOI: https://doi.org/10.52091/EVIK-2022/2-2-HUN

Érkezett: 2021. december - Elfogadva: 2022. március

¹ Novel Food Kft.
² Eurofins Food Analytica Kft.

Kulcsszavak

Sör, palackozógép higiéniai állapota, kisüzemi sörfőzés, tejsavbaktériumok, Entero-bacteriaceae, Bacillus, Pectinatus, Megasphera, vadélesztő, gombák, CIP tisztító rendszer, alfasavak

2. Bevezetés

2.1. Kisüzemi sörgyártás

Magyarországon 2017 óta jogilag azt a főzdét nevezik kisüzemi sörfőzdének, ahol kevesebb mint évi 200.000 hektoliter sört állítanak elő. A 2017 előtti szabályozás még 8000 hektoliternél húzta meg a vonalat, mely alatt 50% jövedéki adókedvezménnyel támogatottak a főzdék [3].

2.2. Gyümölcsös sör

A gyümülcsös sör kategóriába azok a sörök tartoznak amiket valamilyen gyümölccsel, vagy több gyümölcs kombinálásával készítenek. A gyümölcs szót itt konyhai, nem pedig botanikai értelemben használják – húsos, magra asszociáló növényi struktúrák amelyek édesek, vagy savanyúak, és nyersen ehetők. Ide tartoznak például az almatermésűek (alma, körte, birs), a csonthéjasok (cseresznye, szilva, őszibarack, sárgabarack, mango stb.), továbbá amelyek angol nevében megtalálható a “berry” szó (eper, málna, áfonya), ribizlik, citrusfélék, aszalt gyümölcsök (datolya, aszalt szilva, mazsola stb.), trópusi gyümölcsök (banán, ananász, guava, papaya, füge, gránátalma, fügekaktusz stb.). [7]

Ízesített sör: Olyan sör, amelyhez az ízhatás kialakításához a komló helyett, vagy mellett egyéb ízesítőanyagot is felhasználhatnak. Ezen termékek részletes jellemzőit a gyártmánylap rögzíti.

Ízesített sörök esetében az ízesítőanyagot a sörgyártás műveletei – legkésőbb az érlelés vagy szűrés – során adagolják a sörléhez vagy a sörhöz Az érlelés, szűrés folyamán hozzáadott ízesítőanyag következtében a kész sör eredeti extrakttartalma nem növekedhet annak 1/3-ánál nagyobb mértékben. [8]

2.3. Kisüzemi sörfőzdei gyártásindítás

A kisüzemi sörfőzdei gyártásindítás főbb részfolyamatai ideális sorrendben a kövtekezők:

1. Hatósági engedélyezési eljárások lefolytatása
2. A gyártóüzem és segédlétesítmények épületeinek kiépítése
3. Termékfejlesztés
4. A sörfőzdei technológia telepítése
5. Termékgyártás
6. Termékértékesítés

Fontos hangsúlyozni, hogy a hatékony és költségoptimalizált gyártásindítás során a termékfejlesztés megelőzi a sörfőzdei technológia beszerzését, amely részfolyamat kifejezetten az előbbi tapasztalatain alapul. Ez a sorrendiség egy termékfejlesztésre szakosodott szolgáltató szervezet bevonásával oldható meg, amely rendelkezik a folyamathoz szükséges szakmai és technológiai háttérrel.

2.4. A projektünkhöz kapcsolódó technológiai berendezések

A kisüzemi gyümölcsös sör gyártásához az alábbi főbb technológiai berendezéseket telepítettük:

• Malátaroppantó berendezés
• Főzőházi berendezések
• Kombinált cefréző-szűrőkád
• Univerzális komlóforraló - Whirlpool kád
• Elektromos vezérlőpult a sörlégyártás folyamatához
• Sörlé hűtő és rekuperációs berendezések
• Hőellátó berendezések
• Főzőházi kiegészítő berendezések
• Fermentációs tér berendezései
• Hordómosás és töltés berendezései
• Kovaföldes szűrő
• Sörpasztőr
• Palackozógép
• Sűrített levegő ellátó berendezés
• Hűtéstechnológiai berendezések
• Sörüzemi kiegészítő berendezések

A fenti listában kiemelten szerepelnek azok a berendezések, amelyek kifejezetten a sör mikrobiológiai stabilitásának biztosítására, vagy javítására használatosak, vagy azt átlagon felüli mértékben befolyásolják.

3. Mikrobiológiai szempontú gyártásellenőrzés

3.1. A sör mikrobiológiai stabilitása

A sör biológiai stabilitását minden olyan mikroorganizmus veszélyezteti, amely képes a sörben szaporodni, zavarosodást, vagy fenéküledéket képezni és az anyagcseretermékei révén a sört károsítani. E mikroorganizmusok száma csekély, mivel a sör alkoholtartalma, szénsav- és keserűanyag-tartalma és kis pH-ja következtében az adott anaerob feltételek között csak a tejsavbaktériumok és az élesztők képesek fejlődni. E mikroorganizmusok okozta fertőzés és zavarosodás, illetve a fenéküledék megjelenése között egy bizonyos idő telik el, amelynek hossza a fertőzés mértékétől, az organizmusok virulenciájától, a sör minőségétől, az oxigénhez való hozzáféréstől és a tárolás hőmérsékletétől függ.

A mikrobiológiai stabilitás biztosítható biológiailag kifogástalan, erős erjesztőképességű beállítóélesztők alkalmazásával, amelyeknek tömény kultúráját és a tartályok, vezetékek és készülékek hiánytalan mosását, tisztítását és fertőtlenítését ellenőrizték.

Az automatikus tisztítóberendezések különös figyelmet érdemelnek. Az éles szűrés a környezeti levegőtől elzárt fejtéssel együtt és a kellő alapossággal tisztított edények esetén lehetővé teszi, hogy a sört pasztőrőzés nélkül is kiadhassák. Az egyes stádiumokban, mint az erjesztés, ászokolás, szűrés és fejtés, tüzetes mikrobiológiai ellenőrzésre van szükség. [4]

3.2. A sör mikrobiológiai stabilitását befolyásoló tényezők

A sör mikrobiológiailag viszonylag stabil italnak számít. Ehhez a stabilitáshoz hozzájáruló sörparaméterek a következők:

• Etanoltartalom (akár 10% - néha még magasabb is): kimutatták, hogy az 5%-os etanolnak való kitettség növeli a sejtmembrán permeabilitását, és így zavarja a membrán feletti protonmozgató erőt (az energiatermelés szempontjából fontos). Ez azt jelenti, hogy a legtöbb mikroba nem éli túl vagy nem szaporodik a sörben ilyen alkoholszint mellett.
• Szén-dioxid-tartalom (~0,5% v/v): az oldott CO2 anaerob környezetet hoz létre, megakadályozva az aerob romlást okozó mikroorganizmusok növekedését.
• Alacsony pH (pH 3,8-4,7): sok mikroorganizmus nem képes alacsony pH-n (pH<5) növekedni, mivel ezeken az alacsony pH-értékeken nem tudja fenntartani az intracelluláris pH-homeosztázist.
• Izo-alfa savak (15-100 µg/L, a koncentráció ettől eltérő is lehet): az izo-alfa savak antimikrobiális hatást fejtenek ki azáltal, hogy megnövelik a bakteriális sejtmembránok permeabilitását.
• A tápanyagok elérhetőségének csökkenése (a legtöbb fermentálható cukrot az élesztő metabolizálja): sok fontos tápanyag, például szénhidrátok, aminosavak és néhány B-vitamin nagyon alacsony koncentrációban van jelen a sörben, mivel az élesztő ezeket az erjedés során elfogyasztja. Bármilyen megnövekedett tápanyagszint (pl. szénhidrát alacsony alkoholtartalmú sörökben) a romlást okozó mikroorganizmusok elszaporodásának kockázatát jelenti.
• Alacsony oxigéntartalom (lehetőleg 0,1 µg/L alatt): az anaerob körülmények csökkentik az aerob romlást okozó mikroorganizmusok potenciális növekedésének kockázatát.

A modern sörgyártás során számos technikát alkalmaznak, hogy megakadályozzák a mikrobiológiai szennyeződések bejutását vagy túlélését a főzési folyamat, valamint a töltés/csomagolás során, hogy növeljék a mikrobiológiai stabilitást. Néhány példa:

• A cefre forralása, pasztőrözés, vagy steril szűrés a kiszerelés előtt.
• Jól megtervezett sörfőző berendezés, amely ellenáll az agresszív higiéniai eljárásoknak, például a CIP (Clean-In-Place) rendszerű tisztításnak.
• A számos hagyományos (és mikrobiológiailag kockázatos) gyártási eljárás (pl. spontán erjesztés vagy nyitott fermentációs edények) megszüntetése.

3.3. A fertőzési okok

• A „sörszacharina” (Pediococcus cerevisiae) mono- és diplococcusok, vagy tetracoccusok formájában a sört zavarosítják és annak savas, vajra emlékeztető diacetilízt kölcsönöznek.
• A tejsavbaktériumok tejsavat, hangyasavat és ecetsavat termelnek. Zavarosodást, részben pedig fenéküledéket is képeznek.
• A vadélesztők ritkák. A sört zavarossá teszik, leveses fenéküledéket képeznek és többnyire aromás, eltérő, részben durván keserű ízt is kölcsönöznek.
• A kultúrélesztők a lefejtett sörben zavarososdást, fenéküledéket, vagy csak különálló élesztőtelep-képződést idéznek elő. Ha szűrésnél csak tökéletlenül maradnak is vissza, a fejtés alatti gazdag oxigénfelvétel után elszaporodhatnak, elsősorban akkor, ha a sör végerjedésfoka és kiadási erjedésfoka között nagy a különbség. [4]

3.4. Romlást okozó mikroorganizmusok

3.4.1. A sörgyártáshoz és a sörhöz leggyakrabban kapcsolódó mikroorganizmusok

Minden alapanyag (pl. maláta, komló, víz, vagy adalékanyagok) saját specifikus mikroorganizmusokat hordoz. Ezen mikroorganizmusok elszaporodása valamelyik főzési lépés során mellékízeket okozó metabolitok képződését vonja maga után. Abban az esetben, ha ezek a mikroorganizmusok túlélik a sörfőzési folyamat összes lépését - beleértve a pasztőrözést is, amennyiben alkalmazzák – potenciális sörrontóként a kiszerelt sörbe kerülhetnek. A fermentációhoz használt élesztő szintén szennyeződés forrása lehet.

Megfigyeltük, hogy a beélesztőzés során az élesztő kis mennyiségben baktériummal és vadélesztővel szennyeződhet. Ennek elkerülésére az sörélesztő megfelelő kezelésére van szükség.

A szennyeződések további forrásai a sörfőzdei berendezések (edények, csövek) lehetnek, amennyiben nincsenek megfelelően tisztítva és karbantartva. A kiszerelési egység lezárásáig a gyártási folyamat utolsó lépései (erjedés után) is hajlamosak lehetnek a levegőben szálló, vagy a töltőberendezésen lévő mikroorganizmusok általi szennyeződésre (pl. magas páratartalom miatt).

Az 1. ábra a sörfőzdében és a sörben leggyakrabban előforduló romlást okozó mikroorganizmusokat sorolja fel.

A sörben található szennyező baktériumok többnyire a Lactobacillus és a Pediococcus nemzetségbe tartozó tejsavbaktériumok (a sör bakteriális fertőzéseinek több mint 80%-a), de a romlott sörben időnként más anaerob baktériumok, mint például a Pectinatus és a Megasphaera is megtalálhatók. [2]

3.4.1.1. Tejsavbaktériumok [6]

A tejsavbaktériumok olyan szigorúan fermentatív, fakultatív anaerob Gram-pozitív, nem spóraképző pálcák vagy coccusok, amelyek a Lactobacillales rendjébe tartoznak. A legtöbb Gram-pozitív baktériumot gátolják az izo-alfa-savak, azonban néhányuk rezisztenciát mutat ezekkel az antibakteriális vegyületekkel szemben. A két leggyakrabban előforduló tejsavbaktérium a sörben a Lactobacillus brevis és a Pediococcus damnosus. Ezek a baktériumok ecetsavat és tejsavat, valamint különféle mellékízeket, például diacetilt (“vajas” ízt) termelnek. Különösen a Pediococcus-ról ismert, hogy nagy mennyiségű vicinális diketont termel. A Pediococcus alkohol-tűrőképessége is reltíve magas: Még 10% feletti etanolkoncentráción is képes szaporodni. Mindezek mellett a tejsavbaktériumok exopoliszacharidokat (EPS) is termelnek, amelyek a sörben a megnövekedett viszkozitás és a nyálkás megjelenés miatt ún. selymes zavarosságot okoznak.

A legfontosabb Lactobacillus fajok a L. brevis és a L. lindneri; kevésbé gyakoriak a L. rossiae, L. buchneri, L. coryniformis, L. casei és L. backii. A L. brevis gyakran hosszabb, párhuzamos falú, egy- vagy páros, kerek végű pálcát fejleszt (0,7 × 4 μm), a kettős pálcák gyakran hajlítottak. Sejtláncokat nem képez, de a sörben esetenként rendkívül hosszú pálcák (akár 50 μm) is megtalálhatók. A L. brevis általános jellemzője a gázképzés (hetero-fermentatív), a pentózok és melibiózok fermentációja, valamint az arginin hasításának képessége. Ez a leggyakoribb sörrontó zavarosságot és üledéket okoz a sörben, valamint érzékelhetően csökkenti a pH-értéket, ami pedig savas ízt kölcsönöz a sörnek. Diacetilt azonban nem termel. Gyakran másodlagos szennyeződésként jelenik meg.

A L. bucherni a melizitóz erjesztésére képes, ebben különbözve a L. brevis-től. A L. lindneri rövid, enyhén szabálytalan, vagy coccoid sejteket képez, amelyek hosszabb láncokba rendeződnek. Időnként hosszú pálcák alakulnak ki. A heterofermentatív fajok főleg glükózt és maltózt fermentálnak és nem hasítják az arginint. Enyhe üledékesség és zavarosság lehet megfigyelhető a sörben, ennek ellenére ízbeli hibák általában nem fordulnak elő. Ez egy tipikus elsődleges szennyeződés, amely gyakran megtalálható az élesztőüzemben, vagy az erjesztőtérben, de a nagyon kis méretű sejtek révén a szűrőkön keresztül tovább is juthat.

A L. rossiae is hasonló tulajdonságokkal rendelkezik, és nyálkaképző. A fakultatív hetero-erjesztő fajok: L. casei, L. coryniformis és L. plantarum rövidebb pálcákat alkotnak, amelyek gyakran láncokba rendeződnek. Többnyire gyengébben komlózott sörben (pl. búzasör) fordulnak elő, és a diacetilképződés következtében nyilvánvaló ízhibát okoznak. Gyakran másodlagos szennyeződésként jelennek csak meg. Az obligát homofermentatív, sörromlást okozó L. backii mannózt, mannitot és szorbitot erjeszt. A többi fajtól a maltóz és a glükonát fermentációjának hiányában is különbözik.

A P. damnosus-ra jellemző a tetrádok képzése. Tipikusan elsődleges szennyeződések, amelyek gyakran előfordulnak a kultúrélesztőben és a szűretlen sörben. A sejtek a szűrőn keresztül a fejtett sörökbe is átvihetőek. Szennyeződés esetén erős diacetilképződés (vajas íz) és pH-érték csökkenés lép fel, a sörök gyakran enyhén zavarosak és észrevehető üledékképződést mutatnak. Két másik sörromlást okozó Pediococcus faj, a P. inopinatus és a P. claussenii is hasonlóan viselkedik, bár mindkét faj kevésbé elterjedt. Utóbbi nyálkásodást okoz a sörben.

3.4.1.2. Enterobacteriaceae [6]

Az Enterobacteriaceae fakultatív anaerob Gram-negatív baktériumcsalád. A sörfőzéshez általában kapcsolódó két nemzetség a Citrobacter és a Rahnella (a legvalószínűbb, hogy a sörfőzésnél használt víz által jutnak be). Ezek a baktériumok számos olyan mellékíz termelődésért felelősek, mint a VDK-k (pl. diacetil), a 2,3-butándiol, a DMS, az acetaldehid és a tejsav. Ezeket a vegyületeket az erjesztés kezdetén termelik.

3.4.1.3. Bacillus [6]

Gram-pozitív, fakultatív anaerob, spóraképző baktériumok. A spóraképződésnek köszönhetően túlélik a hőkezelést, beleértve a pasztőrözést is. A Bacillus azért is jelent kockázatot, mert képes a nitrátot nitritté redukálni, ami N-nitrózaminok képződését eredményezheti (rákkeltő, teratogén és mutagén anyagok közé sorolják). Mivel egyes Bacillus fajok nagy mennyiségű tejsavat képesek termelni, ezek is savasodást okozhatnak. A legtöbb Bacillus faj (de a spóráik nem) érzékeny a komlóból származó izo-alfa savakra.

3.4.1.4. Pectinatus [6]

Ezek a Gram-negatív, szigorúan anaerob baktériumok nagy mennyiségű ecetsavat és acetoint tudnak termelni, valamint esetükben hidrogén-szulfid termelésről (rothadt tojás aroma) is beszámoltak már.

A Pectinatus cerevisiiphilus és a P. frisingensis szintén szigorú anaerob, kataláz-negatív, Gram-negatív baktériumok, és hasonló negatív hatásokkal bírnak, mint az eddig fesorolt fajok. A sejtek karcsúak (0,8×4 μm), párhuzamos falúak, hegyes végűek, enyhén hajlítottak vagy kígyószerűek, illetve dugóhúzószerűek, valamint egyik oldalukon egy sorosan flagelláltak. A M. cerevisiae-hoz hasonlóan 15-40 °C (optimum: 28-32 °C) tartományban nőnek. Különböző cukrokat, cukoralkoholokat és szerves savakat (főleg piruvát és laktát) fermentálnak. Az elsődleges metabolitok a propionsav, az ecetsav, a piroszőlősav, az acetoin és a CO₂. A általuk szennyezett sörök (pH 4,3 felett, alkoholtartalom 5 térfogat% alatt) nem csak súlyos ülepedési és zavarosodási problémát, hanem kellemetlen szag- és ízhibákat is (szennyvíz szag) mutatnak. A M. cerevisiae-hez hasonlóan ezek is tipikus másodlagos szennyeződések, amelyek elsősorban a palackozótérben fordulnak elő.

3.4.1.5. Megasphaera

A Megasphaera fajok Gram-negatív, szigorúan anaerob szennyeződésként jelenhetnek meg mind a sörlé, mind a kész sör esetében. A sörben zavarosodást okoznak, és nagy mennyiségű hidrogén-szulfidot és számos rövid szénláncú zsírsavat (“sajtos” aroma) termelnek. [2]

A kataláz-negatív, szigorúan anaerob, Gramm-negatív Megasphaera cerevisiae nagy méretű ovális vagy kerek sejteket (1,2-1,6 μm) képez, amelyek diplococcusok és rövid láncok formájában léteznek. Különösen a fruktózt, a piroszőlősavat és a tejsavat erjesztik [6].

Az elsődleges metabolitok a vajsav, az ecetsav, a propionsav, a valeriánsav, valamint a CO2 és a hidrogéngáz. A sörben csak enyhe zavarosság képződik; a fent említett metabolitok következtében azonban jelentős szag- és ízhibák (szennyvíz szag) tapasztalhatóak. A faj alkoholérzékeny (5 V/V% alatt), és kedveli a magasabb pH-értéket (4,4 felett). Tipikusan másodlagos szennyeződések kedvezőek számára, amelyek elsősorban a palackozó berendezés környezetében vannak jelen [6].

3.4.1.6. Vadélesztő

Bármely élesztőtörzs, kivéve a kiválasztott Saccharomyces élesztőt, szennyező. A sörfőzők többnyire vadélesztőnek nevezik ezeket az élesztőszennyezéseket, amelyek lehetnek Saccharomyces cerevisiae vagy nem Saccharomyces törzsek, például Brettanomyces bruxellensis, Candida vagy Pichia. A vad élesztő szaporodása biztonsági kockázatokat hordozhat magában: az alkoholtartalom megemelkedhet a fertőző élesztő anyagcseréje miatt. Ezek a vad élesztők néha képesek dextrineket és keményítőt etanollá erjeszteni (úgynevezett szuperattenuáció). Az etanol előállításával együtt nő a CO₂-tartalom és ezáltal a palacknyomás, ami biztonsági kockázatot jelenthet a palackok szétrobbanása miatt. Ezenkívül a vad élesztő tönkreteheti a sört az észter vagy fenolos mellékíz (pl. 4-vinil-gvajakol) előállítása, valamint zavarosodás vagy üledékképződés révén. Fontos megjegyezni, hogy az elvett élesztősejtek savas mosása nem távolítja el ezeket a vadélesztő szennyeződéseket [5].

3.4.1.7. Gombák

A Fusarium gombák által okozott termőföldi fertőzés komoly élelmiszerbiztonsági veszélyt okoz a gabonáknál. A növénynek szinte minden része (a csíranövény, a gyökér, a szártő, a szár, a levélhüvely, a levél, a kalász és a szemek) megbetegedhet. A súlyosan fertőzött növények kevesebb és gyengébb minőségű termést hoznak, a beteg szemekben méreganyagok (toxinok) képződnek, csírázási erélyük csökken. A betegség kórokozói a különféle Fusarium fajok amelyek fertőzőképessége és méreganyag (toxin) termelése eltérő, amely nagyban összefüggésbe hozható olyan környezeti tényezőkkel is, mint a hőmérséklet vagy a páratartalom. A toxinok jelen lehetnek a sörgyártás teljes folyamatában egészen a palackozott végtermékig. Egyes Aspergillus fajok szintén termelhetnek mikotoxinokat. A Fusarium és az Aspergillus fajok is termelnek hidrofób vegyületeket, kis felületaktív fehérjéket, amelyek kihabzást okoznak [6].

4. Tisztítás, fertőtlenítés

A csövek, tartályok és gépek tisztítása és fertőtlenítése kulcsfontosságú egy sörfőzdében. Minden felületnek és berendezésnek tisztának kell lennie, szennyező baktériumok, élesztőgombák és gombák jelenlétét ki kell zárni.

Példák a sörfőzdében előforduló lehetséges szennyeződésekre:

• Előző főzésből visszamaradó sör
• Mikrobiológiai szennyeződések (élesztők, baktériumok, gombák)
• Komlómaradványok
• Kalcium-oxalát (sörkő, amely savakkal eltávolítható)
• Lipidek, fehérjék (eltávolítás bázisokkal)
• Ásványi lerakódások a vízkörben

Ebben a tekintetben fontos különbséget tenni a tisztítószerek és a fertőtlenítőszerek között.

A tisztítószerek eltávolítják a termékmaradványokat és lerakódásokat, például a lipideket és a fehérjéket. A pH-értéküktől függően ezek a tisztítószerek lúgos, savas vagy semleges tisztítószerek közé sorolhatók. A tisztítási kapacitás további növelése érdekében adalékanyagok, pl. tenzidek adagolhatók. Ezek olyan vízben oldódó molekulák, amelyek csökkentik a víz felületi feszültségét, ezáltal könnyebben eltávolíthatók a szennyeződések.

Fertőtlenítő szereket használnak a legtöbb mikrobiális szennyeződés elpusztítására. Itt ismét fontos kiemelni, hogy a baktériumspórákat nagyon nehéz elpusztítani – ezért is hívják ezt a folyamatot nem sterilizálásnak, hanem fertőtlenítésnek. Példák a fertőtlenítőszerekre:

• Halogéntartalmú fertőtlenítőszerek, például NaOCl (nátrium-hipoklorit). A NaOCl általánosan használt termék, de 40 °C feletti hőmérsékleten instabil (megnövekedett korróziós kockázattal).
• Oxidálószerek, például H₂O₂.
• Kvaterner ammóniumvegyületek (gyakran kvatoknak nevezik). A kvatok kationos tenzidek. Jó tulajdonságai ellenére a kvatokat nem használják olyan gyakran sörfőzdékben, mert jellemzően habképzők és nehezen öblíthetők, ami miatt veszélyeztetik a sör minőségét, pl. ronthatják a habtartósságot.
• Fertőtlenítés gőzzel.
• A kritikus pontok az ún. holtterek (csonkok, ágak a vezetékekben, mintavételi helyek, rossz hegesztés stb.). A csöveket és a tartályokat legjobban egy integrált CIP rendszerrel lehet tisztítani.

5. Laboratóriumi vizsgálatok

5.1. Általános tapasztalatok

A meggyes sör minták, illetve a meggysűrítmények mikrobiológiai vizsgálata során a következőket tapasztaltuk:

• A meggyes sör minták szűrése a magas rosttartalom miatt nem oldható meg.
• Szintén a sörök vizsgálatakor lemezöntéses eljárás esetén nagyméretű Petri-csészében (140x14,8 mm) 10 ml mintát megfelelő 3-5 mm rétegvastagsággal leöntve PCA (mikrobaszám vizsgálat esetén), illetve DRBC (élesztőgomba szám vizsgálatesetén) táptalajjal, az agar a minta alacsony pH-ja miatt nem gélesedik. Emiatt ezen vizsgálatok során először a vizsgálati mennyiséget 10 ml-ről 1 ml-re csökkentettük.
• Ezután megkezdtük a meggysűrítmények mikrobiológiai vizsgálatait is - az alapanyag elvárt sterilitása miatt - egy saját módszerű jelenlét/hiány kimutatással.
• Ezt a módszert tovább módosítva kiterjesztettük a sörök vizsgálatára is. Mivel a kérdés nem a sör sterilitása, hanem a gyakorlati eltarthatósága volt, ezért a végső, módosított megoldásként mindkét vizsgálati irányban dúsításos módszerrel végeztük a szaporodásra képes mikoorganizmusok jelenlét/hiány vizsgálatát, a kész sör receptúrájában lévő azonos mennyiségű gátlóanyagtartalom mellett (0,02 g/L kálium-szorbát). Így gyakorlatilag azt modelleztük, hogy magas tápanyagtartalom mellett a sörben esetlegesen jelenlévő mikroorganizmusok képesek-e szaporodni.

5.2. A meggyes sörök vizsgálati módszereinek leirata

5.2.1. Mikrobaszám, lemezöntés, telepszámlálás (MSZ EN ISO 4833-1:2014, akkreditált módszer)

A mintából az MSZ EN ISO 6887 nemzetközi szabvány szerint elkészítjük az alapszuszpenziót és a decimális hígításokat. Két Petri-csészébe steril pipettával 1 ml mintát (folyadék esetén), vagy alapszuszpenziót adagolunk. Szükség szerint ismételjük meg az eljárást további hígításokkal. Töltsünk 12-15 ml 44-47 °C-os PCA agart minden Petri-csészébe. Fordítsuk meg a Petri-csészéket és inkubáljuk azokat 30 °C-os termosztátban 72±3 órán keresztül.

5.2.2. Élesztőgomba szám, felületi szélesztés, telepszámlálás, vízaktivitás >0,95 (MSZ EN ISO 21527-1:2013, akkreditált módszer)

A mintából az MSZ EN ISO 6887 nemzetközi szabvány szerint elkészítjük az alapszuszpenziót és a decimális hígításokat. Petri-csészékbe töltött DRBC agar felületére 1 ml mintát (folyadék esetén), vagy alapszuszpenziót egyenletesen 3 felé adagolunk, és a mintarészt az agar felületén szélesztjük. Ismételjük meg az eljárást egy további hígítási fokkal, illetve szükség szerint további hígításokkal is. Negyed óra elteltével fordítsuk meg a csészéket és inkubáljuk azokat 25 °C-os termosztátban 3-5 napon keresztül.

5.2.3. Szaporodóképes mikroba, jelenlét-hiány kimutatás, dúsításos technika (saját módszer)

0,33 literes üveges sör kiszerelése esetén a mintát 3 egyenlő részre osztva a mintarészeket 3x100 ml, 0,02 g/liter kálium-szorbát tartalmú alaplevesbe bemérve 72 órán keresztül 30 C°-on inkubáljuk. A tenyésztés végén a dúsításból mintarészenként 1 - 1 db PCA lemezre 1 µl mintarészt kioltunk, majd a lemezeket 72 órán keresztül 30 C°-on inkubáljuk. Amennyiben a lemezen telepnövekedést nem tapasztalunk, az eredményt ‘negatív/100 ml’, telepek kialakulása esetén pedig ‘pozitív/100 ml’ formában adjuk meg.

PCA - Plate Count Agar (agar táptalaj mikrobaszám meghatározáshoz) összetétele:

• tripton 5 g/l
• élesztőkivonat 2,5 g/l
• glükóz 1 g/l
• agar 9 g/l
• pH: 7,0±0,2 (25 °C)

5.2.4. Szaporodóképes élesztőgomba, jelenlét-hiány kimutatás, dúsításos technika (saját módszer)

0,33 literes üveges sör kiszerelése esetén a mintát 3 egyenlő részre osztva a mintarészeket 3 x 100 ml, 0,02 g/liter kálium-szorbát tartalmú malátalevesbe bemérve 72 órán keresztül 25 C°-on inkubáltuk. A tenyésztés végén a dúsításból mintarészenként 1-1 db DRBC agar lemezre 1 µl mintarészt olttounk, majd a lemezeket 72 órán keresztül 25 C°-on inkubáltuk. Amennyiben a lemezen telepnövekedést nem tapasztaltunk, az eredményt ‘negatív/100 ml’, telepek kialakulása esetén pedig ‘pozitív/100 ml’ kifejezéssel adtuk meg.

A DRBC - Dichloran Rose-Bengal Chloramphenicol agar (bengálrózsa diklorán agar) összetétele:

• enzimatikusan emésztett állati és növényi szövetek 5 g/l
• glükóz 10 g/l
• kálium-dihidrogén foszfát 1 g/l
• magnézium szulfát 0,5 g/l
• diklorán (2,6-diklór-4-nitroanilin) 0,002 g/l
• bengálrózsa 0,025 g/l
• agar 15.0 g/l
• pH: 75,6±0,2 (25 °C)

A Takács-féle alapleves (MSZ 3640/13-76) összetétele:

• tripton 4 g/l
• húskivonat 4 g/l
• élesztőkivonat 2 g/l
• nátrium klorid 2 g/l
• dinátrium-hidrogén foszfát 2 g/l
• pH 7,2-7,4 (25 °C)

A laboratóriumi vizsgálatokat az EUROFINS Food Analytica Kft. laboratóriuma végezte.

6. A késztermék és a palackozógép mikrobiológiai állapotának összefüggései

A termékfejlesztés, majd az azt követő gyártás során alkalmazott ellenőrző vizsgálatokat minden esetben kiterjesztettük a technológiai berendezések mikrobiológiai állapotának vizsgálatára. Ezzel egyidejűleg feltártuk a berendezések mikrobiológiai állapotának a termékminőségre gyakorolt lehetséges hatásait.

A projekt során a palackozógépet vizsgálva a készülék olyan gyártási hibáira derítettünk fényt, amelyeket a gyártó a vizsgálataink eredménye alapján később elismert és kiküszöbölt.

• A csapok pneumatikus ágvezetékein a gyártói CIP (Cleaning-In-Place) tisztító és fertőtlenítő program elégtelen hatásidővel volt beállítva
• A kihabosító vízvezeték nem volt bekötve a CIP rendszerbe
• A sörös druck tartály nem volt megfelelően tisztítható a benne található holtterek miatt
• A sörös druck tartály CO2 bevezető ágvezeték nem volt bekötve a CIP rendszerbe

A projektünkben használt palackozógép átalakítás előtti átfogó mikrobiológiai vizsgálatának eredményeit az 1. táblázatban, a palackozógépen töltött sör mikrobiológiai vizsgálatának eredményeit pedig a 2. táblázatban foglaltuk össze. A mikrobiológiai vizsgálatokat az EUROFINS Food Analytica Kft. Laboratórium. A NAH által NAH-1-1582/2021 számon akkreditált vizsgálólaboratórium végezte. A táblázatokban a kifogásolható eredményeket piros színnel emeltük ki.

Vizsgálati módszer - élesztőgomba szám: MSZ ISO 21527-1:2013 [9]
Vizsgálati módszer - mikrobaszám: MSZ EN ISO 4833-1:2014 [10]

Vizsgálati módszer - élesztőgomba szám: MSZ ISO 21527-1:2013 [9]
Vizsgálati módszer - mikrobaszám: MSZ EN ISO 4833-1:2014 [10]

Az átalakítást megelőzően a palackozott gyümölcsös sör annak mikrobiológiai állapotával összefüggésbe hozható minőségi hibái: ízhibák (észteres mellékíz), CO₂ tartalom és ezáltal palacknyomás növekedés, gushing (a söröspalack felnyitásakor spriccelő habos sör).

Javaslatunkra a gyártó a palackozógépen az alábbi átalakításokat végezte el:

• A csapok pneumatikus ágvezetékein megnövelte a CIP program hatásidejét
• A kihabosító vízvezetéket bekötötte a CIP rendszerbe
• Megszüntette a sörös druck tartály holttereit
• A sörös druck tartály CO2 bevezető ágvezetéket bekötötte a CIP rendszerbe

A projektünkben használt palackozógép átalakítás utáni átfogó mikrobiológiai vizsgálatának eredményeit az 3. táblázatban, a palackozógépen töltött sör mikrobiológiai vizsgálatának eredményeit pedig a 4. táblázatban foglaltuk össze.

Vizsgálati módszer - élesztőgomba szám: MSZ ISO 21527-1:2013 [9]
Vizsgálati módszer - mikrobaszám: MSZ EN ISO 4833-1:2014 [10]

Vizsgálati módszer - élesztőgomba szám: MSZ ISO 21527-1:2013 [9]
Vizsgálati módszer - mikrobaszám: MSZ EN ISO 4833-1:2014 [10]

Az átalakítást követően a palackozógép higiéniai állapota megfelelő lett (3. táblázat), és palackozott gyümölcsös sör korábban tapasztalható, annak mikrobiológiai állapotával összefüggésbe hozható minőségi hibái is megszűntek a 4. táblázatban látható vizsgálati eredmények tanúsága szerint. Az elért mikrobiológiai stabilitás révén a trermék minőségmegőrzése biztosíthatóvá vált.

7. Irodalom

[1] Növekedes.hu (2020): A kisüzemi sörfőzdék piaci részesedése 5-6 százalékra nőhet az új törvény hatására. (Hozzáférés: 2021. 10.16.)

[2] 2020. évi CXL. törvény a kereskedelemről szóló 2005. évi CLXIV. törvény módosításáról

[3] A Tanács 92/83/EGK Irányelve (1992. október 19.) az alkohol és az alkoholtartalmú italok jövedéki adója szerkezetének összehangolásáról. 1. szakasz, 4. cikk

[4] Ludwig Narziss (1981): A sörgyártás. Mezőgazdasági Kiadó, Budapest.

[5] KULeuvenX (2021): Beer: the science of brewing. BrewingX. KU Leuven, Leuven, Belgium

[6] Hans Michael Eßlinger (2009): Handbook of Brewing: Processes, Technology, Markets. WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim

[7] Beer Judge Certification Program, Inc. (BJCP) (2015): 2015 Style Guidelines

[8] Magyar Élelmiszerkönyv Bizottság (2013): 2-702 számú irányelv (régi 2-96 számú irányelv) Sör. Magyar Élelmiszerkönyv - Codex Alimentarius Hungaricus. Magyar Élelmiszerkönyv Bizottság, Budapest

[9] MSZ ISO 21527-1:2013 Élelmiszerek és takarmányok mikrobiológiája. Horizontális módszer az élesztők és a penészek számlálására. 1. rész: Telepszámlálásos technika a 0,95-nél nagyobb vízaktivitású termékekre (Microbiology of food and animal fedding stuffs. Horizontal method for teh enumeration of yeasts and moulds. Part 1: Colony count technique in products with water activity greater than 0,95)

[10] MSZ EN ISO 4833-1:2014 Az élelmiszerlánc mikrobiológiája. Horizontális módszer a mikroorganiz-musok számlálására. 1. rész: Telepszámlálás 30 °C-on lemezöntéses módszerrel (ISO 4833-1:2013) (Microbiology of the food chain. Horizontal method for the enumeration of microorganisms. Part 1: Colony count at 30 degrees C by the pour plate technique (ISO 4833-1:2013)

DOI: https://doi.org/10.52091/EVIK-2022/2-4-HUN

Érkezett: 2022. március - Elfogadva: 2022. május

¹ Magyar Tejgazdasági Kísérleti Intézet Kft.
² Széchenyi István Egyetem, Mezőgazdaság- és Élelmiszer-tudományi Kar, Élelmiszer-tudományi Tanszék
³ Széchenyi István Egyetem, Wittmann Antal Növény-, Állat- és Élelmiszer-tudományi Multidiszciplináris Doktori Iskola

Kulcsszavak

probiotikum, Lactobacillus, epesav, gyomorsav, RAPD-PCR, autoaggregáció

2. Bevezetés

A probiotikumok élő mikroorganizmusok, amelyek megfelelő mennyiségben alkalmazva jótékonyan befolyásolják a gazdaszervezet egészségét [1, 2]. Számos feltételnek kell eleget tenniük ahhoz, hogy a probiotikus jelzőt viselhessék. Egyebek mellett fokozott tűrőképességgel szükséges rendelkezniük a különféle testfolyadékokkal (gyomorsav, epesavak, emésztőenzimek) szemben és adhéziós képességük révén, a bélhámszövet sejtjeihez kötődve stabilizálniuk kell a bélmikrobiotát [3].

Az egészségre jótékony hatást kifejtő probiotikus termékek iránt világszerte növekvő igény mutatkozik, legyen szó akár humán táplálkozásról akár haszonállatok takarmányozásáról. Az Európai Unió 2006-tól betiltotta az antibiotikumok hozamfokozó célból történő alkalmazását [4], ezt követően kerültek még inkább a figyelem középpontjába a probiotikumok.

Évről-évre nagyszámú baktériumtörzset izolálnak azzal a céllal, hogy egészségre gyakorolt előnyös hatásaikat kiaknázzák. A komplex és költséges állatkísérleteket meg kell előznie egy in vitro vizsgálatokból álló szelekciós rendszernek, amellyel egyszerűen, gyorsan és költséghatékonyan kiválaszthatók azok a törzsek – a több száz vagy akár több ezer izolátum közül –, amelyek remélhetőleg probiotikusnak bizonyulnak majd az in vivo kísérletek során [5, 6, 7].

Az elmondottak alapján, munkánk célja olyan in vitro mérési módszerek kidolgozása és értékelése volt, amelyekkel gyorsan és hatékonyan lehet baktériumtörzsek klasszikus mikrobiológiai jellemzőit, klonalitását, aggregációs képességét, valamint gyomorsavval és epesavval szembeni ellenállóságát vizsgálni. Arra a kérdésre kerestük a választ, hogy az általunk vizsgált nagyszámú izolátum között találhatók-e klónok és potenciálisan előnyös (akár probiotikus) tulajdonságokkal rendelkező törzsek, melyeket érdemes további in vitro vizsgálatokba bevonni. Azt is vizsgáltuk, hogy a tesztrendszer jól működik-e, avagy az egyes lépéseket esetleg szükséges optimalizálni, továbbá, hogy milyen sav- és epesav-koncentrációkat képesek az egyes törzsek tolerálni, ill. az aggregáció-vizsgálat, a sav- és epesav-tűrés eredményei között van-e bármiféle összefüggés. Ennek megfelelően, az in vitro tesztek közül az alábbi vizsgálati módszerekkel kapott eredményeket mutatjuk be közleményünkben:

• Klasszikus mikrobiológiai vizsgálatok (szelektív táptalajon történő tenyésztés és telepmorfológia megállapítása, Gram-festés és azt követő mikroszkópos vizsgálat, kataláz-próba, hemolízis-vizsgálat)
• Klonalitásvizsgálat RAPD-PCR módszerrel
• Autoaggregáció-vizsgálat
• Savval vagy epesavval kiegészített szilárd táptalaj felületén végzett jelenlét–hiány vizsgálat

3. Anyagok és módszerek

3.1 Baktériumtörzsek izolálása, tenyésztése, tartósítása és tárolása

Vizsgálatainkat Erdélyben előállított nyers juhtej-, aludttej- és juhsajt-mintákból izolált baktériumtörzsekkel végeztük. A termékek természetes mikrobiotával rendelkeztek, gyártásukhoz nem használtak fel kereskedelmi forgalomból származó starterkultúrákat. A sajtok előállításához borjúgyomorból készítettek oltót a juhászok. A cél olyan, nagyhatékonyságú probiotikus törzsek izolálása volt, amelyek később felhasználhatók lesznek probiotikus termékek fejlesztéséhez. A 217 db izolátum és a kontroll törzsek felélesztése, ill. tenyésztése az 1. táblázatban közölt paraméterek szerint történt.

* Clindamycinnel és ciprofloxacinnal kiegészített De Man–Rogosa–Sharpe agar

Az izolátumok tartósítása és tárolása glicerines törzsoldatban történt. 3 ml táplevesbe belemostunk egy oltókaccsal, MRS–CC agar, ill. MRS pH 5,4 agar felületéről levett törzset, majd inkubáltuk a törzs igényeinek megfelelően. A felszaporított tenyészetből krio (fagyasztó) csőbe adagoltunk 300 µl-t, 900 µl 60%-os glicerinoldatot adtunk hozzá, vortexeltük és cseppfolyós nitrogénben fagyasztottuk kb. 30 mp-ig. A tárolás -80 °C-on történt, ultramély-fagyasztóban.

3.2. A szelektív tenyésztés körülményei, tápközegei és elkészítésük

3.2.1. Fiziológiás sóoldat

A decimális hígítási sor előállításához használt hígítófolyadékhoz 8,5 g NaCl-ot és 1 g triptont mértünk be, majd 1 L desztillált vízben feloldottuk. A kémcsövekbe 9,3 ml-t adagoltunk, majd 121 °C-on 15 percig autoklávban sterileztük.

3.2.2. Foszfát-puffer (PBS) oldat

Egy liter desztillált vízhez analitikai mérlegen mértük be az alábbi anyagokat: 80 g nátrium-kloridot, 2 g kálium-kloridot, 14,4 g dinátrium-hidrogén-foszfát-12-hidrátot és 2,4 g kálium-dihidrogén-foszfátot. Mágneses keverővel segítettük az oldódást, majd, amikor az oldat szemcsementessé vált, 121 °C-on, 15 percen át autoklávban sterileztük. Az így elkészült oldat tízszeres töménységű PBS-nek felelt meg, vagyis a további felhasználáshoz hígítani kellett az alábbiak szerint: 900 ml desztillált vízhez adunk 100 ml 10 × PBS oldatot. Megfelelő elegyítést követően használatra kész volt az 1 × PBS oldat.

3.2.3. De Man–Rogosa–Sharpe (MRS) agar és leves (pH = 6,2)

Kereskedelmi forgalomban kapható MRS levesből (VWR, Radnor, PA, USA), ill. MRS agarból (VWR) a gyártó által ajánlott mennyiséget analitikai pontossággal bemértük, majd desztillált vízben feloldottuk, mágneses keverővel oldódásig kevertettük. A kívánt pH-értéket (6,2 ± 0,2) 1 M HCl-oldattal állítottuk be. Ezt követően a tápközegeket autoklávban, 121˚C-on, 15 percig sterileztük.

3.2.4. MRS agar (pH = 5,4)

Az MRS agart (VWR) a gyártó utasításait követve előkészítettük, majd a pH-értékét 1 M HCl-oldattal beállítottuk 5,4-re, végül autoklávban sterileztük standard paraméterek mellett (121 °C, 15 perc).

3.2.5. Clindamycinnel és ciprofloxacinnal kiegészített MRS agar (MRS–CC)

Az MRS‒CC agar az alap MRS agaron kívül két, autoklávban nem sterilezhető antibiotikum-törzsoldatot is tartalmazott. Az egyik törzsoldat elkészítéséhez 10 ml desztillált vízben 2,0 mg clindamycin-hydrocloridot (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA), a másikhoz pedig 10 ml mennyiségű desztillált vízben 20,0 mg ciprofloxacin-hydrocloridot (Sigma Aldrich) oldottunk fel. Ezután 0,22 μm pórusátmérőjű membránszűrőn (Millipore, Burlington, MA, USA) átszűrtük az antibiotikum-törzsoldatokat steril, csavaros kupakkal ellátott Erlenmeyer lombikokba. A 45 °C-ra lehűtött MRS agarhoz aszeptikus körülmények között 0,1 ml clindamycin- és 1,0 ml ciprofloxacin-törzsoldatot adtunk steril, egyszer használatos pipettával (Greiner Bio-One Hungary, Mosonmagyaróvár, Magyarország). Így a clindamycin végleges koncentrációja az alap MRS agarban 0,1 mg/l, a ciprofloxaciné pedig 10,0 mg/l lett.

3.2.6. CASO agar

A CASO-agart (VWR) és CASO-levest (VWR) a gyártó utasításait követve készítettük el. A sterilezés standard paraméterek mellett, 121 °C-on 15 percig, autoklávban történt.

3.2.7. Anaerob tenyésztés

Az anaerob körülményeket a következőképpen biztosítottuk a vizsgálatok során: AnaeroPack Rectangular tégelyben (Merck, Darmstadt, Németország), GENbox anaer anaerob só (bioMériux, Marcy-l’Étoile, Franciaország) hozzáadásával inkubáltuk az agarlemezeket. Az anaerob körülmények fennállásáról a Microbiologic Aerotest indikátor (Merck) fehérről kék színre való változása adott tájékoztatást.

3.3. Klasszikus mikrobiológiai vizsgálatok

3.3.1. Telepmorfológia vizsgálata

A felélesztett törzsek makromorfológiai jellemzőit feljegyeztük. Megfigyeltük többek között a telepek méretét, színét, felületi tulajdonságait (fényes, matt) és a telepek szélének kialakítását (szabályos, szabálytalan, csipkézett).

3.3.2. Gram-festés

Zsírtalanított tárgylemezre egy csepp desztillált vizet cseppentettünk, amiben egy szoliter telepet elszuszpendáltunk. A megszáradt kenetet 2 percig kristályibolya oldattal festettük, majd 1 percig lugol-oldattal kezeltük. Ezt követően desztillált vízzel öblítettük, majd fél percig dekolorizáló oldattal kezeltük a mintát, amely a Gram-negatív sejtekből kivonta a festéket a Gram-pozitívokból viszont nem. Ismét desztillált vizes öblítés következett, majd szafraninnal kontrasztfestést végeztünk 1 percen keresztül. Azután desztillált vizes öblítés következett és hagytuk megszáradni a keneteket, melyeket fénymikroszkóppal (Axio Scope, Carl Zeiss, Oberkochen, Németország), különböző nagyításokban vizsgáltunk meg. A Gram-festés elvégzése azért fontos, mert a potenciális probiotikus tulajdonságokkal bíró tejsavbaktérium törzsek a Gram-pozitív mikrobák közé tartoznak.

3.3.3. Kataláz-próba

Vannak kataláz enzimet termelő mikroorganizmusok, amelyek a mérgező hatású hidrogén-peroxidot vízre és oxigénre képesek bontani (2 H₂O₂ = 2 H₂O + O₂). Annak érdekében, hogy megbizonyosodjunk izolátumaink kataláz-termeléséről, a tárgylemezekre egy kacsnyit tettünk az egy telepre szélesztett friss tenyészetekből, és ezekre 3%-os H₂O₂-t cseppentettünk. Pozitív esetben a telepek elkezdtek jól láthatóan pezsegni. Pozitív kontrollnak S. aureus ATCC 49775 törzset használtunk, amely erős pezsgéssel jelezte a kataláz működését. A kataláz-pozitív törzsek biztosan nem alkalmas probiotikumnak.

3.3.4. Hemolízis-vizsgálat

A hemolízis-vizsgálatok során a frissen felélesztett törzsekből egy-egy telepet vittünk tovább Columbia véres agarra (Biolab Zrt., Budapest, Magyarország). 37 °C-on végzett 24 órás anaerob inkubáció után értékeltük az eredményeket. Pozitív kontrollnak ebben az esetben is S. aureus-t használtunk, amely 5% juhvéres táptalajon β-hemolízist mutat.

3.4. Klonalitásvizsgálat

A baktériumtörzsekből Chelex 100 Resin (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) felhasználásával bakteriális DNS-t izoláltunk, a gyártó által megadott protokoll alapján. A polimeráz-láncreakcióhoz 1,5 ml-es Eppendorf-csőbe összemértük a reakcióelegyet, amely tartalmazta a Red Taq 2 mM MgCl₂ Master Mixet (VWR), az általunk választott, 1254 nevű primert (Bio-Science, Budapest, Magyarország), a molekuláris biológiai tisztaságú AccuGENE vizet (Lonza, Basel, Svájc) és a mintát (baktériumtörzsek DNS templátja). A minták vizsgálatát RAPD-PCR módszerrel végeztük, Mastercycler PCR (Eppendorf, Hamburg, Németország) berendezés RAPD_03 programjával, melynek paraméterei a 2. táblázatban láthatók.

A 2. és a 4. lépés közötti folyamat 40 alkalommal játszódott le. A program lefutását követően, a felsokszorozott DNS-molekulákat gélelektroforézissel tettük láthatóvá és értékelhetővé. A gélelektroforézishez 1%-os agarózgélt készítettünk. Bemértünk 0,6 g agarózt (VWR) és 60 ml 1×TBE TRIS-bórecetsav-oldatban feloldottuk. Az oldatot a teljes elegyedésig forraltuk. Kézmelegre hűtöttük és hozzáadtunk 6 µl DNS ECO Safe festékoldatot (Pacific Image Electronics, Torrance, CA, USA). Közben mágneses keverőn kevertettük, majd gélt öntöttünk. A visszahűlt és festékkel ellátott gélt a tálcába öntöttük. Megszilárdulás után a tálcát belehelyeztük az elektroforézis tankba, amelyet előzőleg feltöltöttünk gélelektroforézis pufferrel (1×TBE-oldat), majd eltávolítottuk a gélfésűt. Az egyes zsebekbe vittük fel a RAPD-PCR reakciótermékeket.

3.5. Autoaggregáció vizsgálata

Az alkalmazott vizsgálati módszer Del Re és mtsai [8] kutatásain alapult, kisebb módosításokkal. A saját izolátumokat és a kontroll törzseket 37 °C-on, 18 óráig, anaerob körülmények között inkubáltuk, 6,2 pH-értékű MRS levesben. Ezután a mintákat centrifugáltuk (Eppendorf Centrifuge 5804 R) 2426 × g-n, 6 percig.

A felülúszót leöntöttük, 1×PBS-oldatból 50 ml-t mértünk a baktériumpelletekre, majd vortexeltük őket (10 sec). Ismét centrifugálás, a felülúszó leöntése és a pellet visszavétele következett 1×PBS-oldatba. Vortexelés után szűkített (semi-micro) küvettákba (Greiner Bio-One Hungary) mértünk 900 µl 1×PBS-t és 100 µl sejtszuszpenziót. Az optikai denzitást 600 nm-es hullámhosszon mértük, BioMate 160 UV-Vis spektrofotométerrel (Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA, USA), majd az OD₆₀₀ értékeket standardizáltuk, 0,2-re állítottuk minden egyes mintánál, hogy a mérési eredmények összehasonlíthatóak legyenek. A beállított értékeket OD₆₀₀ méréssel visszaellenőriztük. Megfelelő értékek esetén 4–4 ml baktériumszuszpenziót adagoltunk ki steril Wassermann-csövekbe, melyeket mintánként A, B és C jellel láttunk el annak érdekében, hogy a három technikai ismétlés biztosítva legyen. Az így elkészített mintákat Wassermann-csövekben, szobahőmérsékleten, aerob módon inkubáltuk a vizsgálat ideje alatt. Az optikai denzitás méréseket a 0., az 5. és a 24. órában végeztük. Az egyes mérési időpontokban 200–200 µl-t vettünk ki a baktériumszuszpenzió felső részéből széles végű pipettaheggyel (Axygen, Union City, CA, USA), majd 800 µl 1×PBS-oldattal hígítottuk, szűkített küvettában. Mindhárom mérési időpontban mindegyik betűjellel ellátott minta OD₆₀₀ értékét háromszor mértük, majd ezekből számoltunk aggregációs százalékot, a García-Cayuela és mtsai [9] által megadott képlet alapján:

[1 − (A_{mérési időpont} / A_{0) × 100],}

ahol: A_{mérési időpont}: a sejtszuszpenzió abszorbancia-értéke az adott mérési időpontban (5 h, 24 h); A₀: a sejtszuszpenzió abszorbancia-értéke 0 h időpontban.

Az autoaggregáció értékelésére jelenleg nincs egységesen kialakított rendszer. Del Re és mtsai [8] vizsgálataik során a >80% aggregációs értékkel rendelkező törzseket jól aggregálódó izolátumoknak minősítették, míg a <10% értéket mutató törzseket nem aggregálódónak tekintették.

3.6. Sav- és epesav-tűrés vizsgálata

3.6.1. A vizsgálathoz szükséges savas és epés táptalajok

A savtűrés vizsgálatához az MRS táptalajt (VWR) előírás szerint előkészítettük, majd 121 °C-on, 15 percig, autoklávban sterileztük. Ezt követően, aszeptikus körülmények között, 1 M HCl-oldattal a következő értékekre állítottuk be a pH-t: 6,0; 5,5; 5,0; 4,0; 3,0. A 45 °C-ra visszahűtött steril táptalajokkal négyzet alakú Petri-csészékbe (Greiner Bio-One Hungary) lemezeket öntöttünk. A 6,0-os pH-értékű MRS táptalaj töltötte be a kezelés nélküli tápközeg szerepét.

Az epesavtűrés teszteléséhez az MRS táptalajt (VWR) a gyártó utasításai alapján készítettük elő. A sterilezés (121 °C-on, 15 perc) után 45 °C-ra visszahűtött alap agarokhoz a sertésepét (Sigma Aldrich) 0,45 μm pórusátmérőjű membránszűrővel (Thermo Fisher Scientific) sterilre szűrve adagoltuk. A kiegészítést úgy hajtottuk végre, hogy a táptalajban az epe végleges koncentrációja 0%, 0,1%; 0,2% és 0,5% legyen. Az epét nem tartalmazó MRS agar töltötte be a negatív kontroll szerepét.

3.6.2. Törzsélesztés és optikai denzitás (OD) mérés

A baktériumtörzseket 6,2-es pH-értékű MRS levesben élesztettük fel, 37 °C-os, 18 órás, anaerob inkubáció eredményeként. A felszaporodott tenyészetek a Falcon cső alján több-kevesebb pelletet képeztek, mindezt értékeltük. A tenyészeteket centrifugáltuk (2426 × g, 6 perc, szobahőmérséklet) (Eppendorf Centrifuge 5804 R). A felülúszót leöntöttük és 1×PBS-oldatba vettük vissza a mintákat. Rövid (10 sec) vortexelés után újra centrifugálás és a felülúszó ismételt leöntése következett. Az 1×PBS oldatba való visszavétel után 10 sec vortexelés következett, majd a szuszpenzió tízszeres hígításának optikai denzitás értékét mértük meg BioMate 160 UV-Vis spektrofotométerrel (Thermo Fisher Scientific), 600 nm-en. A mérést követően egységesen 0,5-es OD₆₀₀ értékű szuszpenziókat készítettünk. A pontosság érdekében visszamértük a beállított sejtsűrűségű szuszpenziók OD₆₀₀ értékeit.

3.6.3. Jelenlét–hiány vizsgálat

Az OD₆₀₀ = 0,5 értékű sejtszuszpenziókból 18 (9 technikai × 2 biológiai ismétlés) × 10 µl-t cseppentettünk az eltérő pH-értékű és epesav-tartalmú táptalajok felületére, majd a 3.2.7. alfejezetben ismertetettek szerint 37°C-on, 48 óráig inkubáltuk a lemezeket.

3.6.4. Epesav- és sósavkezelés folyamata

A vizsgált baktériumtörzseket a táptalajhoz hozzáadott ágensek alapján epesav- és sósav-kezelésnek vetettük alá. Negatív kontrollként epét és sósavat sem tartalmazó, 6,0-os pH-értékű MRS táptalajok szolgáltak. A vizsgálatok menetét az 1. ábra szemlélteti.

3.6.5. Leoltás és élősejtszám-meghatározás

A saját izolátumok és a kontroll baktériumtörzsek tenyészeteiből is decimális hígítási sort készítettünk, majd az egyes hígítási tagokból 100–100 µl-t szélesztettünk el 6,0-os pH-értékű MRS agarlemezek felületén. Az így elkészített lemezeket 37 °C-on, 72 óráig, anaerob körülmények között inkubáltuk. Az inkubációs idő letelte után telepszámlálást végeztünk.

4. Eredmények és értékelésük

4.1. Klasszikus mikrobiológiai vizsgálatok

A klasszikus mikrobiológiai vizsgálatok célja az volt, hogy a Gram-negatív, a kataláz-pozitív és a hemolizáló törzseket kiszelektáljuk. E módszerek alkalmazásával a 217 db izolátumból ki tudtunk szűrni olyanokat, amelyek nem feleltek meg a probiotikumok kritériumainak. A teljesség igénye nélkül, a 3. táblázatban látható a klasszikus mikrobiológiai vizsgálatok eredményei alapján megfelelő jellemzőkkel rendelkező néhány törzs, melyeket a későbbi vizsgálatokba (aggregáció, savtűrés és epesavtűrés vizsgálata) is bevontunk.

*A telepmorfológia vizsgálata 6,2-es pH-értékre beállított MRS agaron kifejlődött törzsekkel történt.

A 217 db izolátum közül 25 db kataláz-pozitív és 29 db Gram-negatív törzset azonosítottunk. Ezeket a klonalitásvizsgálat után a klónosztályokból és a klónosztályba nem illő egyedi törzsek közül is kizártuk. Egyetlen törzs sem hemolizált véresagaron, így jóllehet ez a vizsgálat nem segített szűkíteni a nagy mintaszámot, a probiotikus törzsek biztonságosságának megítéléshez feltétlenül szükséges volt elvégezni.

Sedlačková és mtsai [10] a mi munkacsoportunk gyakorlata szerint szintén csak a Gram-pozitív, pálcika alakú és kataláz-negatív izolátumokat vonták be további in vitro vizsgálataikba. Tanulmányukban összesen 59 db Gram-pozitív és kataláz-negatív törzset különítettek el, melyek közül 7 db-ot nyerstejből, 12 db-ot pedig nyers tehéntejből készített sajtból izoláltak. A telepmorfológia hasonlónak bizonyult a L. acidophilus LA-5 alkotta telepekéhez.

4.2. Klonalitásvizsgálat

A RAPD-PCR vizsgálatok párhuzamosan zajlottak a klasszikus mikrobiológiai vizsgálatokkal. Az egyedi RAPD mintázatok alapján a 217 db törzset 34 klónosztályba soroltuk, ezek közül a 34. klónosztály gélfotója látható a 2. ábrán; a 3. ábrán pedig több klónosztályt és egyedi törzseket is bemutatunk.

A vizsgálatok során 57 db egyedi törzset találtunk, amelyek nem voltak klónosztályokba sorolhatók, így az izolátumok köre 91 db-ra szűkült a klonalitásvizsgálatok eredményei alapján. A klasszikus mikrobiológiai vizsgálati módszerekkel kizártuk a Gram-negatív és a kataláz-pozitív izolátumokat, így összesen 34 db klónosztály és 37 db klónosztályba nem sorolható, egyedi törzs maradt, összesen 71 db izolátumra szűkítve a kiindulási elemszámot. Ez nagyban segítette a preszelekciót, hiszen a törzseknek csak kevesebb mint a harmada (32,7%) maradt fenn a szűrőn. Mivel a RAPD-PCR vizsgálatok eredményei erősen függenek a laboratóriumi körülményektől, a módszer precíz kivitelezése kiemelt fontosságú az eredmények reprodukálhatósága szempontjából [11]. Az alkalmazott 1254-es primer lehetővé tette a RAPD-PCR vizsgálatok során a hasonló mintázatú izolátumok összehasonlítását. Ez egybecseng Torriani és mtsai [12] állításával, miszerint az 1254-es primer kiválóan alkalmazható L. delbrueckii törzsek közötti polimorfizmusok felderítésére.

4.3. Autoaggregáció vizsgálata

A további vizsgálatok során a klónosztályba nem sorolható egyedi törzsekkel (37 db) nem foglalkoztunk, ezért az aggregáció-vizsgálathoz a 34 db klónosztály mindegyikéből egy-egy baktériumtörzset kiválasztva folytattuk az in vitro tesztsorozatot. Célunk az volt, hogy jól aggregálódó (5 órás inkubáció után: >70%, ill. 24 órás inkubációt követően: >80%) és nem aggregálódó (<25%) törzseket találjunk, melyeket a további sav- és epesav-tűrési kísérletekbe be tudunk vonni. Azt feltételeztük, hogy a jól aggregálódó törzsek nagyobb valószínűséggel lehetnek probiotikusak, így esetlegesen a sav- és epesav-kezelést is jobban tolerálják.

Az aggregációs vizsgálat méréseit 0, 5 és 24 óra elteltével végeztük. Az 5. óra utáni vizsgálat mellett Kos és mtsainak [13] eredményei alapján döntöttünk, akik azt tapasztalták, hogy már 5 óra elteltével erősen autoaggregálódott a L. acidophilus M92. A szerzők MRS-levesben tenyésztették teszttörzsüket, mert így megmaradtak az aggregációt lehetővé tevő egyes sejtfelszíni fehérjék [13].

A 34 db törzset két biológiai ismétléssel vizsgáltuk. Találtunk a kezelés 5. órájában 70% feletti aggregációs értéket mutató izolátumokat, szám szerint 6 db-ot (E15, E66, E92, E173, E198, E216). A pozitív kontrollként alkalmazott L. acidophilus LA-5 és ATCC 4356 törzsek szintén jól aggregálódtak (rendre 78,2%, ill. 72,1%) (4. ábra).

Említést érdemel, hogy a jól aggregálódó törzsek szabad szemmel is tisztán látható pelletet képeztek a Wassermann-csövek alján, a szuszpenzió felső része pedig kitisztult. Ugyanerre a megállapításra jutottak García-Cayuela és mtsai [9], akik 126 db L. plantarum törzset izoláltak nyerstejből készített sajtmintákból, és MRS levesben előzetesen szabad szemmel értékelték a törzsek aggregációs (szedimentációs) képességét, melynek alapján hópehelyszerű aggregátumok megjelenéséről számoltak be. Az autoaggregációs vizsgálatba 14 db törzset vontak be, az optikai denzitás méréseket 2, 6, 20 és 24 óra után végezték. A legnagyobb autoaggregációs értékeket (28,5–59,5%) 1 nap elteltével észlelték. Az értékek az idő előrehaladtával növekedtek, azonban törzsenként eltérő módon. Az általuk közölt aggregációs százalékokhoz képest mi nagyobb értékéket (>75%) mértünk 5 órás inkubálás után.

Xu és mtsai [14] probiotikus és patogén törzsek önaggregációs képességét tesztelték. A 2 órás inkubáció után kapott eredmények arról tanúskodtak, hogy három törzs (Bifidobacterium longum B6, L. rhamnosus GG és L. brevis KACC 10553) teljesített jól, 40-50% közötti aggregációs százalékokkal. Tuo és mtsai [15] 22 db Lactobacillus törzs aggregációs képességét vizsgálták 5 órás, 37 °C-os inkubációt követően, és 24,2-41,4%-os értékeket kaptak. Pozitív kontrollként L. rhamnosus GG-t használtak, amely 41,4%-os aggregációs értékével a legjobban teljesítő törzs volt.

Az erdélyi és a kontroll törzsek autoaggregációs vizsgálatának összesített (5 és 24 órás inkubálás utáni) eredményeit a 5. ábra szemlélteti. Megállapítottuk, hogy 24 órás inkubálás után minden egyes törzs nagyobb értéket ért el az 5 órás eredményéhez képest. A kontrollként használt probiotikus L. acidophilus LA-5 és a jól aggregálódó fenotípussal rendelkező L. acidophilus ATCC 4356, szakirodalmi adatokkal egyezően, 24 óra után is kiválóan teljesített (94,1% ill. 93,5%). A 34 db klónosztályba tartozó törzsek közül 19 db 80% felett aggregálódott. A beállított módszerünk tehát alkalmasnak bizonyult a jól és a nem jól aggregálódó izolátumok elkülönítésére. Prabhurajeshwar és Chandrakanth [16] joghurtokból izolált laktobacillusz törzsek 24 órás autoaggregációs vizsgálata során a mi eredményeinknél kisebb értékeket (39,4-52,0%) mértek.

4.4. Sav- és epesav-tűrés vizsgálata

A sav- és epesav-tűrés vizsgálatához az 5 óra inkubáció után jól aggregálódó 6 db törzset (E15, E66, E92, E173, E198, E216) használtuk, pozitív kontrollként pedig a L. acidophilus LA-5 szolgált, mely utóbbi törzs probiotikus, megfelelőek az aggregációs mutatói és korábban hasonló vizsgálatokban már jól szerepelt [17]. Ezen kívül, a saját izolátumok közül az E10-es, kevésbé jó aggregációs képességgel (22,7%) rendelkező törzset is bevontunk vizsgálatainkba, hogy megállapíthassuk, van-e összefüggés a jó aggregálódás, ill. a sav- és epesav-tűrés között.

Az eredményeket 48 órás inkubálást követően olvastuk le. A táptalaj felületére inokulált 10 µL térfogatú baktériumszuszpenzió-cseppek helyén telepek növekedését vagy a szaporodás hiányát észleltük. Azt bíráltuk el szabad szemmel, hogy a törzsek képesek voltak-e a savval, ill. epével kiegészített és a kontroll táptalajok felületén jól látható mértékben elszaporodni (jelenlét–hiány vizsgálat). Arra kerestük a választ, hogy egyrészt mekkora sav- és epesav-koncentrációt képesek tolerálni az egyes törzsek, másrészt van-e összefüggés az aggregálódó képesség és a sav-, ill. epesav-tűrés között. Eredményeinket a 4. és az 5. táblázatban szemléltetjük.

* n = 18 (9 párhuzamos × 2 ismétlés).
0: nincs szaporodás, +: gyenge szaporodás, ++: közepes mértékű szaporodás, +++: jól látható, erőteljes szaporodás.

* n = 18 (9 párhuzamos × 2 ismétlés).
0: nincs szaporodás, +: gyenge szaporodás, ++: közepes mértékű szaporodás, +++: jól látható, erőteljes szaporodás.

Látható, hogy a L. acidophilus LA-5 a 6,0-os, 5,5-es, 5,0-ös és 4,0-es pH-értékű MRS táptalajokon és a 0,1%, valamint 0,2% epesav-tartalmú MRS táptalajokon megfelelően szaporodott, tehát jó sav- és közepes epesav-tűrőnek bizonyult. A 0,5% epét tartalmazó táptalajon már gyenge növekedést mutatott a kontrolltörzs. A legsavasabb (pH = 3,0) MRS tápközegen se a kontroll, se a vizsgált erdélyi törzsek nem képeztek telepeket, előszelekcióra tehát a 4,0-es és a 3,0-as pH-értékű szilárd tápközegek bizonyultak megfelelőnek.

Pan és mtsai [18] csecsemők székletéből izolált L. acidophilus NIT törzset tartottak glicin–sósav pufferben (pH: 2,0; 3,0; 4,0) 1, 2, ill. 3 órán keresztül. A kezelés után a baktériumpelletet reszuszpendálták és a megfelelő hígítási tagokból MRS agarlemezek felületén 20 µL szuszpenziót szélesztettek el. Azt tapasztalták, hogy 3 óra kezelés után a L. acidophilus-sejteknek mindössze 10%-a maradt életben. Jóllehet a mi vizsgálataink nem ugyanebben a kísérleti elrendezésben zajlottak, az eredmények magyarázatul szolgálhatnak arra, hogy a L. acidophilus a 3,0-as pH-értékű táptalajunkon miért nem képzett telepeket. Vargas és mtsai [19] 3% savófehérje-izolátum adagolásával érték el, hogy a Streptococcus thermophilus ST-M5 és a L. delbrueckii subsp. bulgaricus LB-12 maximális számban élje túl a savkezelést. Valente és mtsai [20] célja az volt, hogy felmérjék tradicionális brazil sajtokból izolált tejsavbaktérium-törzsek (L. plantarum B7 és L. rhamnosus D1) in vitro és in vivo probiotikus potenciálját. Mindkét törzs közepes mértékben tolerálta a 0,3% ökörepét 12 óra inkubáció elteltével. A mesterséges emésztőnedvekkel (pH: 2,0 és 3 g/L pepszin) szemben a B7 és a D1 izolátum is ellenállónak bizonyult [20].

Az epesavas sók fiziológiás koncentrációja 0,3% és 0,5% között változik az emésztőtraktusban [21], ezért választottuk legnagyobb epekoncentrációnak a 0,5%-ot. A nevezett szerző szintén hozzáadott táptalajához 0,3, 0,5, 1,0, ill. 2,0% epesavas sót, majd a törzskultúra 10 µL-ét juttatta a tápközeg felületére. Ugyan nem Lactobacillus, hanem nyers tehén- és kecsketejből, valamint tradicionális kefirből izolált Lactococcus törzsekkel dolgozott, vizsgálati rendszere mégis hasonlított a miénkhez. A Lactococcus lactis törzsek nem tolerálták az alkalmazott epesav-koncentrációk egyikét sem.

Eredményeink alapján megállapítottuk, hogy a kiválasztott izolátumok többnyire jól tolerálták a 0,5%-os epesav-jelenlétet, ami viszont nem volt igaz az E10 jelű törzsre, amely még a legkisebb (0,1%) epekoncentráció mellett is csak alig szaporodott. Az E10 izolátum gyenge aggregációs képessége jó savtűréssel és gyenge epesavtűréssel társult. A L. acidophilus LA-5 kontrolltörzs gyengén ugyan, de még a 0,5% epét tartalmazó táptalajon is szaporodott. Az alkalmazott eljárás során a törzsek nemcsak pár óráig voltak kitéve a pusztító hatású összetevőknek, hanem 48 órán keresztül érintkeztek azokkal. Említést érdemel, hogy a destruktív ágensek negatív hatásait a tápközeghez adagolt savófehérjeporral lehet mérsékelni [19]. A savval és epesavval kiegészített szilárd táptalaj felületén végzett jelenlét–hiány vizsgálat viszonylag gyors módszernek tekinthető, mert a szükséges táptalajok könnyen elkészíthetők, a táptalaj felületére történő cseppentés gyorsan kivitelezhető, így az eredmények rövid időn belül rendelkezésre állnak.

5. Következtetések

A probiotikus baktériumtörzsek szelektálására alkalmas in vitro tesztrendszer néhány elemének kidolgozására irányuló törekvésünk sikeresnek bizonyult. Az itt bemutatott lépéseket nem feltétlenül szükséges tovább finomítani, mert jelenleg is képesek nagy elemszámú izolátumhalmazok előszelektálására. Noha az 1254-es primer jó választásnak bizonyult, a későbbi klonalitásvizsgálatok során érdemes lesz más primerekkel is elvégezni a RAPD-PCR reakciót. Az aggregációs vizsgálatok, valamint a sav- és epesav-tűrés tesztek eredményei között pozitív összefüggés mutatkozott, mindazonáltal az izolált törzsek probiotikus tulajdonságainak tényszerű megállapításához további in vitro vizsgálatokra és in vivo állatkísérletekre van szükség. A jelenleginél is nagyobb szelekció érdekében érdemesnek tűnik a tesztrendszert egyéb elemekkel kiegészíteni, pl. antibiotikumrezisztencia- vagy antimikrobiális aktivitás-vizsgálatokkal.

6. Köszönetnyilvánítás

A szerzők köszönik az EFOP-3.6.3-VEKOP-16-2017-00008 azonosítószámú, „Innovatív tudományos műhelyek a hazai agrár felsőoktatásban” című projekt és az EFOP-3.6.1-16-2016-00024 azonosítószámú, „Intelligens szakosodást szolgáló fejlesztések az Állatorvostudományi Egyetem és a Széchenyi István Egyetem Mezőgazdaság- és Élelmiszer-tudományi Karának együttműködésében” című projekt anyagi támogatását.

7. Irodalom

[1] Hill, C., Guarner, F., Reid, G., Gibson, G.R., Merenstein, D.J., Pot, B., Morelli, L., Canani, R.B., Flint, H.J., Salminen, S., Calder, P.C., Sanders, M.E. (2014): The International Scientific Association for Probiotics and Prebiotics consensus statement on the scope and appropriate use of the term probiotic. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology 11 pp. 506-514. DOI

[2] Fijan, S., Frauwallner, A., Varga, L., Langerholc, T., Rogelj, I., Lorber, M., Lewis, P., Povalej-Bržan, P. (2019): Health professionals’ knowledge of probiotics: an international survey. International Journal of Environmental Research and Public Health 16 pp. 3128. DOI

[3] Szakály, S. (2004): Probiotikumok és Humánegészség. Vissza a Természethez! Magyar Tejgazdasági Kísérleti Intézet, Mosonmagyaróvár.

[4] European Parliament, Council of the European Union (2003): Regulation (EC) no. 1831/2003 of the European Parliament and of the Council of 22 September 2003 on additives for use in animal nutrition. Official Journal of the European Union L268 pp. 29-43.

[5] Papadimitriou, K., Zoumpopoulou, G., Foligné, B., Alexandraki, V., Kazou, M., Pot, B., Tsakalidou, E. (2015): Discovering probiotic microorganisms: in vitro, in vivo, genetic and omics approaches. Frontiers in Microbiology 6 pp. 58. DOI

[6] Williams, C.F., Walton, G.E., Jiang, L., Plummer, S., Garaiova, I., Gibson, G.R. (2015): Comparative analysis of intestinal tract models. Annual Review of Food Science and Technology 6 pp. 329-350. DOI

[7] Antal, O., Némethné Szerdahelyi, E., Takács, K. (2020): In vitro humán emésztési modellek alkalmazása a táplálkozástudomány területén (Application of in vitro human digestion models in the field of nutrition science). Élelmiszervizsgálati Közlemények - Journal of Food Investigation 66 pp. 3141-3157.

[8] Del Re, B., Sgorbati, B., Miglioli, M., Palenzona, D. (2000): Adhesion, autoaggregation and hydrophobicity of 13 strains of Bifidobacterium longum. Letters in Applied Microbiology 31 pp. 438-442. DOI

[9] García-Cayuela, T., Korany, A.M., Bustos, I., de Cadiñanos, L.P.G., Requena, T., Peláez, C., Martínez-Cuesta, M.C. (2014): Adhesion abilities of dairy Lactobacillus plantarum strains showing an aggregation phenotype. Food Research International 57 pp. 44-50. DOI

[10] Sedláčková, P., Horáčková, Š., Shi, T., Kosová, M., Plocková, M. (2015): Two different methods for screening of bile salt hydrolase activity in Lactobacillus strains. Czech Journal of Food Sciences 33 pp. 13-18. DOI

[11] Pereszlényi, K. (2019): Tejsavbaktériumok genetikai azonosságának vizsgálata molekuláris markerekkel. Szakdolgozat. Széchenyi István Egyetem, Mosonmagyaróvár.

[12] Torriani, S., Zapparoli, G., Dellaglio, F. (1999): Use of PCR-based methods for rapid differentiation of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus and L. delbrueckii subsp. lactis. Applied and Environmental Microbiology 65 pp. 4351-4356. DOI

[13] Kos, B., Šušković, J., Vuković, S., Šimpraga, M., Frece, J., Matošić, S. (2003): Adhesion and aggregation ability of probiotic strain Lactobacillus acidophilus M92. Journal of Applied Microbiology 94 pp. 981-987. DOI

[14] Xu, H., Jeong, H.S., Lee, H.Y., Ahn, J. (2009): Assessment of cell surface properties and adhesion potential of selected probiotic strains. Letters in Applied Microbiology 49 pp. 434-442. DOI

[15] Tuo, Y.F., Yu, H.L., Ai, L.Z., Wu, Z.J., Guo, B.H., Chen, W. (2013): Aggregation and adhesion properties of 22 Lactobacillus strains. Journal of Dairy Science 96 pp. 4252-4257. DOI

[16] Prabhurajeshwar, C., Chandrakanth, K. (2019): Evaluation of antimicrobial properties and their substances against pathogenic bacteria in vitro by probiotic lactobacilli strains isolated from commercial yoghurt. Clinical Nutrition Experimental 23 pp. 97-115. DOI

[17] Süle, J., Varga, L., Varga, K., Hatvan, Z., Kerényi, Z. (2022) Probiotikus baktériumtörzsek szelektálására alkalmas kísérleti rendszer egyes elemeinek kidolgozása (Developing basic elements of an experimental system for selection of probiotic bacterial strains). Magyar Állatorvosok Lapja 144 (közlésre benyújtva).

[18] Pan, X.D., Chen, F.Q., Wu, T.X., Tang, H.G., Zhao, Z.Y. (2009): The acid, bile tolerance and antimicrobial property of Lactobacillus acidophilus NIT. Food Control 20 pp. 598-602. DOI

[19] Vargas, L.A., Olson, D.W., Aryana, K.J. (2015): Whey protein isolate improves acid and bile tolerances of Streptococcus thermophilus ST-M5 and Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus LB-12. Journal of Dairy Science 98 pp. 2215-2221. DOI

[20] Valente, G.L.C., Acurcio, L.B., Freitas, L.P.V., Nicoli, J.R., Silva, A.M., Souza, M.R., Penna, C.F.A.M. (2019): Short communication: In vitro and in vivo probiotic potential of Lactobacillus plantarum B7 and Lactobacillus rhamnosus D1 isolated from Minas artisanal cheese. Journal of Dairy Science 102 pp. 5957-5961. DOI

[21] Yerlikaya, O. (2019): Probiotic potential and biochemical and technological properties of Lactococcus lactis ssp. lactis strains isolated from raw milk and kefir grains. Journal of Dairy Science 102 124-134. DOI

DOI: https://doi.org/10.52091/EVIK-2022/2-5-HUN

Érkezett: 2022. január – Elfogadva: 2022. március

¹ Dél-uráli Állami Egyetem
² Dél-uráli Állami Agráregyetem
³ Antey Kft.

Kulcsszavak

tartósítószer, antioxidáns, friss húskészítmények, összcsíraszám, élesztő, eltarthatóság, tárolás, mikrobiológia

2. Bevezetés

Az élelmiszerek és nyersanyagok hatékony tartósításának problémája előállításuk, tárolásuk, szállításuk és kereskedelmük minden szakaszában, beleértve az otthoni élelmiszer-tartósítást is, napjainkban aktuális kérdés. Egyes becslések szerint a világon megtermelt élelmiszer akár 25%-a is érzékeny lehet csak a penész károsító hatásaira [1].

Az élelmiszerek tartósításának és mikrobiológiai romlásuk megelőzésének jelenlegi módszerei három csoportra oszthatók: fizikai, kémiai és biológiai módszerek. A fizikai módszerek közé tartozik a hőmérsékleti expozíció (melegítés és hűtés), a szárítás, a vákuumozás stb. A kémiai módszerek közé tartozik a sózás, a füstölés, a sós vizes kezelés, a tartósítószerek használata stb. A biológiai módszerek a starter és bioprotektív kultúrákkal történő kezelésből, baktericidek és enzimkészítmények alkalmazásából állnak [2, 3]. Ezen módszerek mindegyikének vannak bizonyos korlátai egy adott termék előállítása során az érzékszervi tulajdonságokra és tápértékre gyakorolt hatásuk, valamint műszaki megvalósíthatóságuk miatt (például a szükséges felszerelés igénye, vagy a felhasznált anyagok és készítmények szűkössége). A mikrobiológiai romlás megelőzésének összes ismert módszere közül a kémiai tartósítószereket tartják a legkönnyebben alkalmazhatónak, gyorsan megvalósíthatónak, amelyek nem igényelnek speciális felszerelést és/vagy gyártási módot [4, 5]. A húsipar azonban meglehetősen konzervatív az élelmiszer-adalékanyagok felhasználását illetően, mivel a kémiai tartósítószerek csak korlátozottan engedélyezettek a húskészítmények gyártása során, elsősorban a kocsonyás termékek gyártásában és a felületkezelésben [6]. Emellett a fogyasztók túlnyomó többsége elutasítóan viszonyul a tartósítószert tartalmazó címkézett húshoz. E tekintetben a kémiai tartósítószerek felhasználása a húskészítmények előállítása során jelentősen korlátozott, és nem tekinthető a mikrobiológiai romlás megelőzése univerzális eszközének.

Oroszországban a sertéshús fogyasztási szintje és termelése az utóbbi időben gyorsan növekedett. Elmondható, hogy a sertéshús manapság uralja a húsipart. 2020-ban a sertéshústermelés 23%-kal nőtt.

A sertéshús teljes értékű állati fehérje forrása is, és magas tápértékkel rendelkezik. Ezenkívül a sertéshús az emberi szervezet átfogó fejlődéséhez szükséges vitaminokat, makro- és mikroelemeket tartalmaz [7].

Ahhoz, hogy az egészségre gyakorolt kedvező tulajdonságokat egészében megőrizzük, be kell tartani a hús feldolgozási, szállítási és tárolási szabályait. A Sanitary Rules and Norms SanPiN 2.3.2.1078-01 és a Technical Regulations of the Customs Union TRCU 034/2013 „On the safety of meat and meat products” szerint a sertéshús a romlandó áruk kategóriájába tartozik.

A tárolási körülményeket és feltételek megsértése esetén jelentősen felgyorsul a mikroorganizmusok növekedése és szaporodása a friss sertéshúsban, ami a bakteriális szennyeződés fokozódásához vezet. Kedvező körülmények között a mikroorganizmusok a felületen felhalmozódnak és fokozatosan behatolnak a hús mélyére, ami a termék megromlását okozza. Tárolás során a hús elveszti értékes tulajdonságait, érzékszervi, fizikai és kémiai paraméterei jelentősen romlanak, és a patogén mikrobiális flóra élettevékenysége miatt megnő az emberi egészség károsodásának kockázata. A húsromlásnak többféle típusa van: rothadás, nyálkaképződés, penészképződés, savas erjedés (hússavanyodás) stb. Ezeknek a folyamatoknak az intenzitása a hőmérséklettől, a relatív páratartalomtól, a mikroorganizmus típusától és a hús kezdeti szennyezettségének mértékétől függ [8].

Rothadásos romlás leggyakrabban a helyes tárolási feltételek sérülése esetén fordul elő. A rothasztó mikroflóra a hús romlását okozza. A rothasztó mikroorganizmusok lehetnek akár aerobok, akár anaerobok. Képesek olyan proteáz enzimeket kiválasztani, amelyek lebontják a fehérjéket. Ezen mikroorganizmusok között vannak aerob bacillusok (B. pyocyaneum, B. mesentericus, B. subtilis, B. megatherium), anaerob clostridiumok (Cl. putrificus, Cl. histolyticus, Cl. perfringens, Cl. sporogenes) és fakultatív anaerob coccusok. Az aerob rothadás végtermékei az ammónia, a szén-dioxid, a kén-hidrogén és a merkaptánok. Ezen vegyületek mindegyike károsíthatja az emberi szervezetet, ami súlyos mérgezésben nyilvánulhat meg [9].

A sertéshús anaerob rothadása oxigén nélkül következik be. Emiatt még a vákuumcsomagolás sem védi meg a húst a romlástól, ha a tárolási hőmérsékletre vonatkozó követelményeket megsértik. Az anaerob rothadás végtermékei az aminosavak dekarboxilezésének termékei, amelyek kellemetlen szagú anyagok képződését okozzák, mint például az indol, a szkatol, a fenol, a krezol és a diaminok. Származékaik hullamérgek (kadaverin, putreszcin stb.); mérgezőek az emberre, és halált is okozhatnak [10].

A nyálkaképződés nyálkaképző mikroorganizmusok (tejsavbaktériumok, élesztőgombák és mikrococcusok) elszaporodásának és részleges elhalásának eredménye a sertéshús felületén. A hús 18-25 ºC-on történő tárolása és a magas páratartalom hozzájárul a nyálkaképződéshez. Azonban egyes nyálkaképző mikroorganizmusok akár fagypont alatti hőmérsékleteken is kifejlődhetnek. A nyálkaképződés során a hús felülete ragacsossá válik, szürkés-zöld árnyalatot és visszataszító szagot kap, a hús felületi rétegeinek pH-ja 5,2-5,3 lesz. Fontos különbséget tenni a nyálkaképződés és a rothadás kezdeti szakasza között, mivel ezeket teljesen más mikroflóra okozza [11].

A húsromlás egy másik, hasonlóan veszélyes típusa a penészképződés, amely akkor következik be, amikor a termék hosszan tartó tárolása során mikroszkopikus gombák fejlődnek ki annak felületén. A penészesedés során a hús minősége a fehérjék hidrolízise és az aminosavak dezaminációja miatt romlik. A húsfelületeken leggyakrabban előforduló gombák, a Mucor, a Penicillium, az Aspergillus és a Cladosporium, alacsony hőmérsékleten (hűtőszekrényben) is képesek növekedni. Ezek a gombák mikotoxinokat termelnek, élelmiszerromlást, allergiás reakciókat és különféle betegségeket okoznak az emberi szervezetben [12, 13].

Dolgozatunk célja a tartósítószer keverékben lévő élelmiszer adalékanyagok vegyületei hatásának vizsgálata (részletesebben lásd a 3.1. szakaszt) a friss sertéshús tárolás közbeni mikrobiológiai romlással szembeni ellenálló képességére.

3. Anyagok és módszerek

3.1. A kutatás tárgyai

A cikkben szereplő kutatási tárgyak a következők:

• Durvára vágott friss sertéshúr (legfeljebb 15 tömegszázalék zsírtartalommal)
• Egy tartósítószerként alkalmazott élelmiszer-adalékanyag vegyületei. A felhasználásra kész keverék a következőket tartalmazza: kálium-szorbát (E202), nátrium-acetát (E262), nátrium-benzoát (E211), glicerin (E422), karboximetil-cellulóz (E466) és egy antioxidáns (dihidrokvercetin). Az adalékanyagot egy oroszországi kutató és gyártó társulás állítja elő.
• Tejsav
• Ecetsav
• Nátrium-acetát (E262)

3.2. Kutatási módszertan

Az összcsíraszámot és az élesztő mennyiségét úgy határoztuk meg, hogy a terméket táptalajt tartalmazó agarlemezekre szélesztettük, hagytuk a mikroorganizmusokat kinőni, majd megszámoltuk az összes különálló telepet.

A peroxid- és savszámot standard módszerekkel határoztuk meg [14, 15]. A peroxidszám meghatározásának módszere az állati zsírok oxidációs termékeinek (peroxidok és hidroperoxidok) kálium-jodiddal való reakcióján alapul ecetsav és izooktán vagy kloroform oldatában, amit a felszabaduló jód mennyiségi meghatározása követ nátrium-tioszulfát-oldattal titrimetriás módszerrel. A savszám meghatározásának módszere a minta oldószerkeverékben történő feloldásán, és a szabad zsírsavak kálium-hidroxid-oldattal történő titrálásán alapul.

Minden vizsgálatot három párhuzamosban végeztünk el, hacsak másképp nem jelezzük, és kiszámoltuk az átlagértékeket. Az eredményeket átlagérték ± szórás formában fejeztük ki. Az átlagértékek közti szignifikáns különbségeket p < 0,05 szignifikanciaszinten egytényezős varianciaanalízis és Student-teszt segítségével azonosítottuk. Statisztikai elemző szoftverként a Microsoft Excel 2010-es verzióját alkalmaztuk.

4. Eredmények és diszkusszió

A tartósítószer keverék funkcionális tulajdonságainak azonosítására hűtött sertéshúsokon végeztük vizsgálatokat, összehasonlítva kontrollmintákkal és a leggyakoribb tartósító hatású anyagokkal (tejsav, ecetsav és nátrium-acetát). Elvégeztük a húskészítmények mikrobiológiai mutatóinak összehasonlító értékelését, melynek során 7 napon keresztül, 8-10 oC-os hőmérsékleten monitoroztuk a mezofil aerob és a fakultatív anaerob mikroorganizmusok (MAFAM) mennyiségét. A kísérleti eredményeket az 1. ábra mutatja.

A húsdarabok romlásának leggyakoribb mutatója a természetes savas erjedés. A glikogénben gazdag izomszövetben rendszerint savas fermentáció alakul ki. A folyamat fő jelei a savanyú szag, a szürke vagy zöldes árnyalat, a szövetek rugalmasságának csökkenése, és ennek következtében egy laza konzisztencia. A hiba okozói pszichotróf tejsavbaktériumok és élesztőgombák, amelyek a szénhidrátokat szerves savakká, valamint gázokká (szén-dioxid és esetenként hidrogén) erjesztik. A hús szénhidrátjain kívül az apróra vágott hústermékek olyan szénhidrátokat is tartalmaznak, amelyek hagymából, pácokból és egyéb összetevőkből származnak. Ezek a sertéshúsdarabok közötti sós lében található szénhidrátok kedvező táptalajt jelentenek a savas erjedés kórokozóinak növekedéséhez.

Kísérleti vizsgálataink kimutatták, hogy a kiválasztott tartósítószerek a tárolás során aktívan gátolják a mikrobiális növekedést. Így a hetedik napon a mikróbatartalom a kontrollmintában 12·10⁴ CFU/g volt, a tejsavat tartalmazó mintában 2·104 CFU/g, az ecetsavat tartalmazó mintában 1,8·104 CFU/g, a nátrium-acetátot tartalmazó mintában 0,7·10⁴ CFU/g, a tartósítószer keverék vegyületeit tartalmazó mintában pedig 0,1·10⁴ CFU/g.

Az élesztőgombák kifejlődésének megakadályozása a húsdarabokban a nyershústermékek gyártói sikerének fontos eleme, mivel ez közvetlen kapcsolatban van a termék eltarthatóságával, és garantálja a fogyasztó felé a termék biztonságosságát [16].

A húskészítmények szennyeződése a dolgozók szennyezett kezétől, szennyezett tárolóedényektől, nem sterilizált fűszerektől és hagymától származik. A 2. ábra a különböző tartósítószerek hatását mutatja az élesztő növekedésére nyers húsokban a tárolás során.

Kutatási eredményeink szerint a klasszikus tartósítószerek (tejsav, ecetsav és nátrium-acetát) gyenge hatással bírnak az élesztő növekedésére és szaporodására a nyers sertéshús tárolása során. Az élesztő gyors szaporodása friss sertéskarajban a 2. napon indul meg, és a 7. napon éri el csúcsértékét, 1.600 CFU/g-ot (kontrollminta). A tartósítószer keverék vegyületeinek alkalmazása azonban lehetővé teszi az élesztő szaporodásának aktív visszaszorítását a friss sertéshúsból készült termékek hosszú távú tárolása során (250 CFU/g).

A kapott adatok megerősítik, hogy a tartósítószer keverék nemcsak hatékonyan gátolja az élesztőgombák szaporodását, hanem egyértelmű antimikrobiális aktivitást is mutat a mikroorganizmusok széles körével szemben.

A durvára vágott friss sertéshús mikrobiológiai mutatóinak tanulmányozása során megállapítottuk, hogy a sós lében áztatott hússzeletek felületén az élesztőtartalom több százszorosa a belső szövetekben mért értékeknek. Ennek ismeretében nyilvánvaló, hogy leginkább a hús felületét, valamint a sós lében lévő összetevőket kell kitenni a tartósítószerek hatásának. Ennek az állításnak az igazolására azonos receptúra szerint készített nyers sertéshúsok mikrobiológiai mutatóit hasonlítottuk össze, amelyek a tartósítószer alkalmazásának módjában különböztek. Az egyik mintában a tartósítószert oldat formájában fecskendővel alkalmazták, egy másikban pedig folyadék formában, összekeverve hagymával és páclével, majd a húsba masszírozva. A kontrollmintát tartósítószer nélkül készítettük el. A kísérleti eredményeket a 3. ábra mutatja.

A masszírozást „Metat master” húspácoló gépben végeztük, a kiválasztott keverőprogram szerint. A keverési paraméterek az 1. táblázatban láthatók.

Így ennél a mintatípusnál a legracionálisabb módszer a tartósítószer alkalmazására a nyers hússzeletekkel történő összekeverés és bemasszírozás (például fűszerekkel vagy pácokkal együtt). Ebben az esetben egyszerre két pozitív hatás érhető el: az élesztő által érintett területeken nő a tartósítószer koncentrációja, és a tartósítószer összmennyisége a termékben csökken, ami mind a fogyasztók egészségére vonatkozó termékbiztonság, mind gazdasági szempontból előnyt jelent.

A tartósítószer keverékkel tartósított termék eltarthatósági ideje növekedésének vizsgálatát különböző időpontokban végeztük el (5-30 nap) úgy, hogy 5 naponta megmértük az elsődleges és másodlagos lipidbomlási termékeket, valamint meghatároztuk a peroxid- és savszámot [17].

Az élelmiszer-adalékanyagot különböző koncentrációkban alkalmaztuk (0,1%, 0,4%, 0,6% és 1%).

A kapott adatok alapján meghatároztuk a minták peroxidszám (PN) értékének függését a termék tárolási időtartamától (4. ábra).

A tartósítószer keverék dózisától függően a PN értékek változnak, de minden esetben az idő múlásával növekvő tendencia figyelhető meg. A legmagasabb mértéket a kontrollmintában mutattuk ki. Az oxidációs folyamatok legalacsonyabb arányát a 0,6% illetve 1% tartósítószert tartalmazó mintákban figyeltük meg, és ezek szignifikáns eltérést mutattak a kontrollmintától.

A 10. napon minden tartósítószer keveréket tartalmazó minta PN értéke meredek (átlagosan 1,6-szeres) emelkedést mutatott, ami a pácban található ecetsav és az antioxidáns (dihidrokvercetin) kölcsönhatását idézi elő, ami a savasság eltolódásával jár együtt a lúgos tartomány felé. A tárolás 15. napján a PN érték fokozatosan tovább növekszik, és az élelmiszer-adalékanyag hatóanyaga a teljes tárolási idő alatt gátolni kezdi a lipid peroxidációt, szignifikáns eltéréseket mutatva a kontrollmintától. 30 nap tárolás után a kontrollmintában az oxidációs folyamatok észrevehető növekedése figyelhető meg, így ezt választottuk a friss hús eltarthatóságának végpontjául. Az antioxidáns aktivitás azonban lehetővé teszi a termék tárolási stabilitásának növelését.

Hasonló dinamika figyelhető meg a savszám változásában (5. ábra).

A túlzott savasságú oxigéntartalmú termékek a nedvességveszteség miatt rontják a hús minőségét. A húskészítmények mérsékelt savassága viszont kisebb mértékben rontja a termék minőségét, így az lédús marad. Ezenkívül a tartósítószer keverékben található antioxidáns lehetővé teszi az eltarthatóság növelését.

5. Következtetések

Kutatásunk újszerűségét elméletileg igazoltuk, és kísérletileg megerősítettük az élelmiszer-adalékanyag tartósítószer keverék vegyületeinek magas teljesítményét a nyers sertéshús gyártása során. Az adalékanyag alkalmazása lehetővé teszi a húskészítmények hőkezelése és tárolása során fellépő veszteségek csökkentését, a hozam növelését és az állag javítását, valamint az előállítási költségek csökkentését és az eltarthatósági idő növelését akár 30 napra. Ezt az eredményt a legújabb, széles spektrumú antimikrobiális tartósítószer keverék alkalmazása biztosítja. A készítmény jelentős baktériumölő hatással rendelkezik, gátolja az élesztőgombák növekedését és fejlődését. A készítmény alkalmazásának legracionálisabb módja egy húsrendszerben az, ha összekeverjük a termékkel, és belemasszírozzuk abba (például fűszerekkel vagy pácokkal). Mivel a tartósítószer tartalmazza a természetes antioxidáns dihidrokvercetint, a készítmény előnyösen alkalmazható magas zsírtartalmú termékek esetén a lipidfrakció tárolás közbeni oxidációjának megelőzésére. A készítmény optimális koncentrációja a húsrendszerben 0,6-1 tömegszázalék. Magasabb koncentrációk a végtermék magasabb árához vezetnek. Ugyanakkor a bio-tartósítószer 0,6 tömegszázaléknál kisebb koncentrációja csökkenti a termék tárolási stabilitását és ellenállást a mikrobiális romlással szemben.

6. Összeférhetetlenség

Kijelentjük, hogy nincsen olyan pénzügyi és személyes kapcsolatunk más személyekkel vagy szervezetekkel, amelyek elfogadhatatlan módon befolyásolhatnák munkánkat, és semmilyen termékhez, szolgáltatáshoz és/vagy céghez nem fűződik semmilyen szakmai vagy egyéb személyes érdekünk, amely befolyásolhatná ennek a cikknek a tartalmát.

7. Köszönetnyilvánítás

A munkát az Oroszországi Föderáció kormányának 211. számú törvénye támogatta, szerződésszám: 02.A03.21.0011.

8. Irodalom

[1] Saucier, L. (2016): Microbial spoilage, quality and safety within the context of meat sustainability. Meat Science, 120, pp. 78–84. DOI

[2] Huffman, R. D. (2002): Current and future technologies for the decontamination of carcasses and fresh meat. Meat Science, 62, pp. 285–294. DOI

[3] Zhang, H. Z., Wu, J., Guo, X. (2015): Effects of antimicrobial and antioxidant activities of spice extracts on raw chicken meat quality. Food Science and Human Wellness, 5, pp. 39-48. DOI

[4] Chen, J. H., Ren, Y., Seow, J., Liu, T., Bang, W. S., Yuk, H. G. (2012): Intervention Technologies for Ensuring Microbiological Safety of Meat: Current and Future Trends. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 11, pp. 119–132.

[5] Naveena, B. M., Sen, A. R., Vaithiyanathan, S., Babji, Y., Kondaiah, N. (2008): Comparative efficacy of pomegranate juice, pomegranate rind powder extract and BHT as antioxidants in cooked chicken patties. Meat Science, 80, pp. 1304–1308, DOI

[6] Aymerich, T., Picouet, P. A., Monfort, J. M. (2008): Meat decontamination technologies for meat products. Meat Science, 78, pp. 114–129. DOI

[7] Lucera, A., Costa, C., Conte, A., Del Nobile, M. A. (2012): Food applications of natural antimicrobial compounds. Frontiers in Microbiology, 3, pp. 1–13. DOI

[8] Russell, S. M. (2009): Understanding poultry spoilage. Last accessed 14th April 2017.

[9] Doulgeraki, A. I., Ercolini, D., Villani, F., Nychas, G. E. (2012): Spoilage microbiota associated to the storage of raw meat in different conditions. The International Journal of Food Microbiology, 157, pp. 130–141. DOI

[10] Soladoye, O. P., Juárez, M. L., Aalhus, J. L., Shand, P., Estévez, M. (2015): Protein oxidation in processed meat: mechanisms and potential implications on human health. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 14, pp. 106–122. DOI

[11] Thomas, C. J., O’Rourke, R. D., McMeekin, T. A. (1987): Bacterial penetration of chicken breast muscle. Food Microbiology, 4(1), pp. 87–95. DOI

[12] Scallan, E., Hoekstra, R. M., Angulo, F. J., Tauxe, R. V., Widdowson, M. A., Roy, S. L., Jones, J. L., Griffin, P. M. (2011): Foodborne illness acquired in the United States-major pathogens. Emerging Infectious Diseases, 17, pp. 7–15. DOI

[13] Waites, W. M. (1998): The microbiology of meat and poultry. Meat Science, 50(1), p. 137. DOI

[14] Antipova, L. V., Glotova, I. A., Rogov, I. A. (2001): Meat and meat products research methods, Moscow, Kolos, pp. 376.

[15] Skurikhin, I. M., Tutelyan, V. A. (1998): Guide to methods for analysis of food quality and safety. Moscow, Brandes, Medicine, pp. 342.

[16] Viljoen, B. C., Geornaras, A., Lamprecht, A., Holy, A. (1998): Yeast populations associated with processed poultry. Food Microbiology, 15, pp. 113-117. DOI

[17] Aminzare, M., Hashemi, M., Ansarian, E., Bimkar, M., Azar, H. H., Mehrasbi, M. R., Daneshamooz, S., Raeisi, M., Jannat, B., Afshari, A. (2019): Using Natural Antioxidants in Meat and Meat Products as Preservatives: A Review. Journal of Animal and Veterinary Advances, 7, pp. 417–426.

DOI: https://doi.org/10.52091/EVIK-2021/1-3-HUN

Érkezett: 2020. szeptember – Elfogadva: 2020. december

¹ Széchenyi István Egyetem Mezőgazdaság- és Élelmiszertudományi Kar, Élelmiszertudományi Tanszék, Mosonmagyaróvár

Kulcsszavak

joghurtkészítés, mikrohullámú besugárzás, gyümölcsaszalás, mikrobiológiai paraméterek, összcsíraszám, élesztőszám, penészszám, Escherichia coli, coliform

2. Bevezetés és szakirodalmi áttekintés

A tej az emberiség táplálkozásának egyik alapját képezi az emberiség történelmének kezdetétől fogva. Hasznos összetevői kedvező hatást gyakorolnak az ember egészséges testi és szellemi fejlődésére. A tej alkotórészei élettani szempontból előnyösek, ezek közül is magas kálcium tartalma kiemelkedő, ennél fogva a fejlődő szervezet csontképzésében játszik szerepet [1], valamint a szervezet számára fontos és jól hasznosítható fehérjéket is tartalmaz. Mindezen tulajdonságai révén a tejtermékek az emberi táplálkozás alapélelmiszereinek tekinthetők. Az élelmiszeriparban számos haszonállat tejét feldolgozzák (juh, kecske, szarvasmarha), de Magyarországon legnagyobb mennyiségben a tehéntejet fogyasztják.

A joghurt olyan tejipari termék, amelyet az egész világon fogyasztanak. A táplálkozástudománnyal foglalkozó szakemberek úgy vélik, hogy ez a savanyú tejkészítmény magas táplálkozási értékkel (laktóztartalmának jelentős része elbomlik a fermentáció során és jelentős Ca⁺⁺ koncentrációval rendelkezik) és előnyös bioaktív hatásokkal (prebiotikus összetevők és probiotikus baktériumok) bír. A natúr joghurtot olyan tejsavbaktériumok hozzáadásával állítják elő, amelyeknek alapvető élettani tevékenységük során a táptalajban tejsavas erjedés zajlik. Az összes, tejből előállított termék közül a joghurt a legnépszerűbb világszerte. [2].

Gyümölcsjoghurt esetében, ha szárított gyümölcsöket vagy szárított darabokat adnak a joghurthoz, a szárítmányok hajlamosak felszívni a joghurtgél szabad vízének egy részét, és ezáltal segítik a termék savójának elválasztását a tárolás során [3]. A gyümölcs adagolásának az is előnye, hogy egyes kutatások [4] szerint 10 v/v%-nyi gyümölcs adalékanyag hozzáadása szignifikánsan javítja a termék fizikai-kémiai tulajdonságait. Az egészséges növényi szövetek belseje nem tartalmaz mikroorganizmusokat, így a növényi nyersanyagok elsődleges mikrobiotája főként a talajból, a vízből, a levegőből esetenként rovaroktól vagy állatoktól származik. A talajban (gumók, gyökerek) és a talaj közelében fejlődő növényi részek általában erősen szennyezettek, mikroflórájuk összetétele gyakorlatilag megegyezik a talajéval. A gyümölcsök felületén körülbelül 10³-10⁵ CFU/g nagyságrendben találni mikroorganizmusokat, amelyek egy jelentős részét a tejsav- és az ecetsavbaktériumok teszik ki. A mikrobiota legnagyobb részét azonban az élesztőgombák alkotják, amelyek közül a leggyakoribbak a Hensaniaspora, Torulaspora, Pichia, Saccharomyces, Candida és a Rhodotorula fajok. Gyakori romlást okozó mikroorganizmusok a gyümölcsöknél az Alternaria, Aspergillus, Fusarium, Monilia és a Mucor fajok. A gyümölcsök a penészgombák kiváló táptalajai, melyek között sok mikotoxin termelő is van. A nyersanyag szennyezettsége és a helytelen tárolási körülmények gyakran lehetővé teszik mérgező anyagcseretermékek képződését is. Penészes gyümölcsökből (elsősorban almából és körtéből) mutatható ki például a patulin az Aspergillus és Penicillum gombák által termelt méreganyag (mikotoxin) [5].

A gyümölcsök technológiai feldolgozása során a darabolás, szeletelés, aprítás, hámozás növeli annak valószínűségét, hogy más anyagokról, eszközökről és felszerelésekről származó keresztszennyezés következik be a gyártás és a feldolgozás különböző szakaszaiban. Ezenkívül a cukrok és más tápanyagok megnövekedett elérhetősége a minimálisan feldolgozott gyümölcsökben hozzájárul a mikrobiota változásához és növeli annak populációját [6, 7]. A nyersanyag mikrobiotájának fő tényezői a gyártás során felhasznált anyagok és a feldolgozó berendezések felületének higiéniája, a gyártási környezet és az élelmiszer-kezelők higiéniája, amelyek meghatározzák a végtermék mikrobiológiai minőségét és biztonságát. [8, 9, 10]. Egy, a minimálisan feldolgozott növényi élelmiszerekkel kapcsolatos tanulmány szerzői nagy összes aerob mikroorganizmus-számot mutattak ki az élelmiszerekkel érintkező felületeken, különösen a hámozóberendezéseken, késeken és a vágódeszkákon [10]. Ugyanezen kutatók számoltak be arról is, hogy a vágóasztalokon és a vágódeszkákon magas az Enterobacteriaceae család fakultatív anaerob baktériumainak száma [10]. Bár minden feldolgozóüzem gyártási folyamatai között alkalmaznak mosási és egyéb szennyeződés-mentesítési eljárásokat, mégis nehéz elérni a mikrobiális szennyeződések nagymértékű csökkentését. [11]. A csomagolás és a tárolás időszakában is kialakulhatnak kedvező feltételek a gyümölcsökben és zöldségekben előforduló mikroorganizmusok szaporodásához. Lehto és munkatársai vizsgálataik során aerob mikroorganizmusok nagy számát fedezték fel zöldségfeldolgozó üzemek felületi mintavételei során a már tisztított zöldségekkel érintkező eszközökön és berendezéseken, valamint a tároló-, feldolgozó- és csomagoló helyiségek légterében [10].

Az élelmiszeriparban a hőkezelési eljárások az élelmiszerbiztonság legfontosabb meghatározói. A tej hőkezelése azért van szükség, hogy annak mikrobiológia biztonsága garantálható legyen a tejben lévő patogén mikroorganizmusok elpusztítása révén. Az élelmiszeriparban többféle hőkezelési módszert alkalmaznak. A hőkezelés hatékonyságát szigorúan meghatározott hőmérséklet és hőntartási idő biztosítja. A termékek alapanyagain kívül fontos szerepet tölt be az adalékanyagok megfelelő mikrobiológiai tulajdonságainak biztosítása is. „A hőkezelés a tej, a tejszín stb. melegítésével, hevítésével kapcsolatos művelet, amelynek célja a mikroorganizmusok számának csökkentése, elpusztítása” [12]. A hőkezelés a tejfeldolgozás során általános technológiai lépés, amelynek célja a tej eltarthatóságának javítása a mikroorganizmusok és enzimek inaktiválásával. A kedvező mikrobiológiai állapotú alapanyag használata javíthatja egyes tejtermékek, például a joghurt textúrájának minőségét [13] is.

A mikrohullámú technikát, mint hőkezelési eljárást, elsősorban a háztartásokban használják. Az élelmiszeriparban jelenleg csak egyes területeken tudják megbízhatóan alkalmazni. Ennek oka, hogy a mikrohullámú berendezésekben a hőátadás nem egyenletes, a termékben alul- vagy túlmelegített helyek alakulnak ki. Csőben áramoltatott folyadékoknál – pl. tej mikrohullámú energiával történő kezelése esetén – ez elkerülhető [5]. Ahol használható ez a technika, ott előnyt jelent, mivel az élelmiszereknél alkalmazott kezelések ideje lecsökkenthető, így a technológia gazdaságossá tehető. A költséghatékonyság mellett további előny, hogy a hő- és anyagtranszport iránya azonos, így nem alakul ki az áramlást gátló száraz kéreg [14]. Alkalmazási területei: szárítás, mélyhűtött hús kiolvasztása, temperálás, pasztőrözés, sterilizálás és az élelmiszerek elszíneződésének megakadályozására [15, 16].

A mikrohullámú sugárzásnak sterilizáló és mikrobapusztító hatást is tulajdonítanak. Pozar kísérletei során [17] ezt a hatást 2450 MHz, néhány esetben pedig már 915 MHz frekvencia alkalmazása mellett tudta biztosítani. A sugárzás azáltal növeli az élelmiszerek minőségmegőrzési idejét, hogy az élelmiszerekben található mikrobákat elpusztítja és/vagy szaporodásukat gátolja.

Mikrohullámú sugárzás mikrobákra kifejtett hatását sokféle élelmiszerben, élelmiszer alapanyagban, főleg húsfélékben vizsgálták. A mikrohullámú pasztőrözés [18] elterjedését segítette, hogy alkalmazásával az élelmiszereknél nagymértékű károsodással nem kell számolni, szemben a hagyományos hőközlési eljárásokkal. Ennek oka a rövid hőkezelési és besugárzási idő [19, 20].

A mikrohullámú kezelési technológia mellett hagyományosabb eljárásnak minősül az aszalás, amelynek lényege az, hogy a gyümölcsből – esetenként zöldségből – kíméletes hőközléssel kivonják a víztartalom nagyrészét, ezt követően visszamarad egy intenzív ízű koncentrátum, a kiindulási anyagnál lényegesen kisebb tömegben és méretben. Így az aszalványon maradó mikroszkopikus élőlények a hozzáférhető víz hiánya miatt elvesztik élet- és szaporodó képességüket. A friss gyümölcsök 90-95% vizet tartalmaznak, amely az aszalás után 15% alá csökken. Ilyen módon baktériumok és penészek által előidézett romlás megelőzhető, miközben bizonyos tápanyagok, ballasztanyagok és ásványi anyagok megmaradnak, közülük például a vas. Az aszalt gyümölcsök a friss gyümölcsökhöz képest sok szénhidrátot, rostot és antioxidánsokat, flavonoidokat, fenolsavakat, karotinoidokat és vitaminokat tartalmaznak koncentrált formában [21, 22].

Az élelmiszeripar változatos összetételű joghurt-készítményt állít elő, de a gyártásuk során alkalmazott technológiai műveletek a tej beoltásáig közel azonosak. A tejet általában 2-3%-os starterkultúrával oltják be és 40-45 °C-on inkubálják. Ebben a hőmérsékleti tartományban a kívánt végső savtartalmat 3-4 óra alatt állítják be. Alacsonyabb hőmérséklet (30-37 °C) alkalmazása esetén a művelet hosszabb ideig tart (7-8 óra) ebben az esetben viszont megakadályozható a termék túlzott savasodása [23].

A joghurt ízéért, illatáért és textúrájáért elsősorban a Streptococcus thermophilus baktérium a felelős, és valójában önmagában is képes a pasztőrözött tejet joghurttá erjeszteni, ennek ellenére a fermentációhoz a Streptococcus mellett a Lactobacillus bulgaricus-t is alkalmazzák a termékben keletkező savak előállítása érdekében. A S. thermophilust és az L. bulgaricust általában 1:1 arányban egyszerre oltják be a tejbe (pH 6,6). Arányuk az erjedés előre haladtával megváltozik [24].

3. Anyag és módszer

A termékek gyártása

A termékek gyártásához nyers, hőkezelés nélküli, valamint 2,8 %-os zsírtartalmú UHT fogyasztói tejet (Mizo) használtunk fel, amelyet 2:1 arányban elegyítettünk a joghurtok készítése előtt. A nyerstejet 75 °C-on 15 percig főzőlapon pasztőröztük a megfelelő kezdeti mikrobiológiai biztonság elérése érdekében, majd hozzáadagoltuk a fogyasztói tejet. A hőkezelés után megvártuk, amíg a tej hőmérséklete 30 °C-ra csökken, majd beoltottuk a felhasználási útmutató szerinti mennyiségű (YF-L812, Chr. Hansen, Franciaország) termofil joghurtkultúrával (Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus és Streptococcus thermophilus) és 15 percig kevertük a megfelelő homogenitás biztosítása érdekében. A beoltott tejet 2 dl-es műanyag joghurtos poharakba adagoltuk és 43 °C-os termosztátba (Binder, Németország) helyeztük, ahol 7 órán át alvasztottuk őket (pH 4,6). A savas alvadás után a joghurtokba kevertük az alábbi eljárásokkal kezelt gyümölcsöket.

Kísérletünk során a kontrollminta kivételével kétféle hőkezelési eljárást alkalmaztunk a gyümölcsök esetében, mikrohullámú hőkezelést és hagyományos hőkezelési eljárást (aszalás).

A kísérlet során beállított minták:

• 1. minta: gyümölcsös joghurt - nyers alma hozzáadásával (Ny-A)
• 2. minta: gyümölcsös joghurt - nyers banán hozzáadásával (Ny-B)
• 3. minta: gyümölcsös joghurt - aszalt alma hozzáadásával (A-A)
• 4. minta: gyümölcsös joghurt - aszalt banán hozzáadásával (A-B)
• 5. minta: gyümölcsös joghurt - mikrohullámmal hőkezelt alma hozzáadásával (MH-A)
• 6. minta: gyümölcsös joghurt - mikrohullámmal hőkezelt banán hozzáadásával (MH-B)

A nyers gyümölcsöket tiszta, nyomódástól és hibás részektől mentes, kifogástalan állapotban, optimális érettségi fokban dolgoztuk fel.

A mikrohullámú kezeléshez a MARS 5 (CEM Corporation, USA) mikrohullámú roncsoló berendezést használtunk. A felkockázott nyers almát és banánt a mikrohullámú berendezés mintatartójába helyeztük, majd mikrohullámú kezelésnek vetettük alá. A készüléken az energiaközlési programot úgy állítottuk be, hogy 800 W teljesítménnyel 100%-os hatásfokkal 10 perces hőntartási idővel, a gyümölcsök 55 °C-ra melegedjenek fel, összesen 15 perc alatt. A hőmérséklet detektálását és kontrollálását a mintatartóba vezetett szenzor (RTP 300) segítségével végezte el a berendezés.

Az aszalási folyamatban felhasznált gyümölcsöket egyenlő méretű cikkekre (0,5 cm) vágtuk, hogy azonos idő alatt száradjanak, majd ezután 55 °C-on 24 órán át aszalóberendezésbe helyeztük. Az aszalt, illetve mikrohullámmal hőkezelt gyümölcsöket ezután ledaráltuk. A használat előtt a késeket és a darálóberendezést Mikrozid fertőtlenítővel kezeltük. A ledarált gyümölcsökből 5-5 grammot adagoltunk 150 ml, már elkészült joghurtmintákhoz. A további vizsgálatokig a joghurt-gyümölcs-aszalvány keverékeket hűtőszekrényben 4 °C hőmérsékleten tároltuk.

3.2. A termékek eltarthatósági vizsgálatai

A termékeket 4 héten át vizsgáltuk eltarthatóság szempontjából. A vizsgálatokat a 0., 7., 14., 21. és 28. napon végeztük el. A mikrobiológiai tulajdonságok (összcsíraszám, élesztő/penész-szám, E. coli/coliform-szám) vizsgálatára a gyártástól számítva heti rendszerességgel került sor. A kísérletet minden mintavételi napon 3 párhuzamos méréssel végeztük el (n=3), tehát mintánként (Ny-A; Ny-B, A-A; A-B; MH-A; MH-B) 15 mintával, így a mérések során összesen 90 mintával dolgoztunk.

A mikroorganizmusok tenyésztéséhez lemezöntéses eljárást alkalmaztunk. Élelmiszer-biztonsági és technológiai higiéniai szempontból a 105/cm3 összcsíraszám jelenti nyerstej esetében a kritikus határt, mert a normál pasztőrözési eljárások ennél a mikrobaszámnál még kellő hatékonysággal alkalmazhatók.

Az összes mikrobaszám meghatározását PC (Plate Count, Biolab) táptalajon végeztük el, 30±1 °C-on 72 órás inkubációs idővel [25]. Az MSZ ISO 7954:1999 szabványban rögzített szelektív táptalajon, 25 °C-on való tenyésztéssel az élesztő- és penészgombák telepeket képeznek. A kimutatásukra a szabvány által meghatározott YGC agart (Yeast Extract Glucose Chloramphenicol Agar, Biolab) használtunk. Ez a szelektív táptalaj tejből és tejtermékekből az élesztők és fonalasgombák izolálására és számolására alkalmas. A lemezeket 48 órán át 25±1 °C-on inkubáltuk, ezután a kifejlődött telepeket a lemezeken megszámoltuk [26].

A coliform-szám és az E. coli-szám együttes meghatározását CC agar (ChromoCULT Coliform Agar, Biolab) alkalmazásával lehet megoldani. A telepek elkülönítését segíti, hogy a coliform telepek színe lazac- piros, az E. coli telepek pedig sötétkéktől az ibolyáig változtatják színüket. Az inkubációs paraméterek E. coli/coliform esetében 24 óra 35-37 °C [27].

Mérési eredményeinket Microsoft Office Excel 2016® program segítségével ábrázoltuk. A mikrobiológiai eredmények kiértékelése során a mikrobaszámokat logaritmizált formában jelenítettük meg: az egyes pontokra illesztett egyenesek meredekségi értékei a mikroorganizmusok exponenciális szaporodási fázisát jellemzik.

4. Eredmények és értékelés

4.1. Az almás joghurt minták vizsgálati eredményei

4.1.1. Összcsíraszám

Az 1. ábrán tanúsága szerint a mérés 0., 7. és 14. napján is az összcsíraszám az aszalt almás joghurt és a mikrohullámmal kezelt almás joghurt esetében közel azonos eredményeket mutat. A nyers almás joghurt már a 2. mérés (7. nap) alkalmával magasabb összcsíraszám-értéket értékeket mutatott a másik két mintához képest. Itt már szignifikáns eltérést tapasztalunk a sejtszámok között, amely eltérés az idő elteltével csak növekedett (14. nap). A mikrohullámmal kezelt almával és az aszalt almával kiegészített joghurt esetében a sejtszámok növekedésének tendenciája hozzávetőlegesen azonos mértéket mutatott. Ezt az eredményt az 1. ábrán megjelölt meredekség-értékek is alátámasztják.

4.1.2. Élesztő/Penész-szám

A 2. ábra alapján megállapítható, hogy az első mérési adattól kezdve az utolsó mérési eredményig a mikrohullámmal kezelt és az aszalt almás joghurt szignifikánsan alacsonyabb élesztőszámot mutat, mint nyers almás joghurt értékei. A MH-A és A-A minták között nem alakult ki ilyen nagyságrendű különbség, azonban a mérés 21. napján már itt is egyértelmű, szignifikáns különbség mutatkozott a MH-A javára. Ezek alapján a mikrohullámmal végzett hőkezelés bizonyult hatásosabbnak az élesztőgombák élettevékenységének gátlásához az általunk alkalmazott kezelési beállítások mellett.

Az almával kiegészített joghurtok esetében egyértelműen megállapítható, hogy az összcsíraszám, az élesztő- és penészszám esetén egyaránt a mikrohullámú technológia mutatkozott a legjobb kezelési eljárásnak. Ehhez hasonló sejtszámokat és szaporodási tendenciákat eredményezett az aszalt gyümölcs adalékot tartalmazó joghurt. A tárolási idő elteltével azonban itt már a sejtszámok között nagyobb különbségek alakultak ki. Eltarthatóság szempontjából a legrosszabb eredényeket a nyers nyümölcsös minták esetében kaptuk. Nagyságrendnyi különbségeket mértünk a másik két mintához képest, szignifikáns elétrések voltak tapasztalhatók (p≤0,05).

A 21. napon, a harmadik mintavételi időpontban a mikrohullámmal kezelt almás joghurtokat leszámítva, a nyers, és az aszalt almás joghurtok megromlottak. A harmadik mérés után a nyers, valamint az aszalt almás joghurtokban a magas élesztőgombaszám mellett jelentős számú penészgomba jelent meg. A mikrohullámmal kezelt almás joghurtokon ezzel szemben a harmadik mérést követően sem voltak kimutatható penészgombatelepek.

Penészgombaszámra vonatkozóan a hatályos rendelet [27] alapján a fermentált tej, tejtermék, savanyított tejtermék, túró, túrókészítmények esetén a megfelelőség szint (m) 10² CFU/cm³ a visszautasítás határértéke (M) 5*10³ CFU/cm³.

Penészgombák tekintetében az almás joghurtok esetében az első két mérés alkalmával, a 0. és 7. napon nem mutattuk ki a penészgombák jelenlétét. A kísérlet 14. napján a nyers gyümölcsös és az aszalt almás mintánál megjelentek a penészgombák telepei, nyers alma estében már a rendelet által meghatározott visszautasítási szint feletti értékkel (3*104 CFU/cm3). Az aszalt almás termék esetében azonban a vonatkozó előírások szerint [27] még elfogadható szinten (2,2*102 CFU/cm3) marad penészgomba-telepek száma.

4.2. A banános joghurt vizsgálati ereményei

4.2.1. Összcsíraszám

A banános joghurtok esetében megállapítottuk, hogy a kétféle kezelési eljárás (aszalás, mikrohullám) szintén hatással van a mikrobaszám alakulására. A mikrohullámmal kezelt minta esetén a mikrobaszám emelkedése a kísérlet 21. napjáig nem mutatott intenzív növekedést a kezdeti sejtszámhoz képest (3. ábra). Ezzel ellentétben a nyers és aszalt gyümölccsel kiegészített joghurtok esetében az összcsíraszám hétről-hétre emelkedett. Mindezek mellett azt is megállapítottuk, hogy az aszalt gyümölccsel kiegészített minta sejtszáma a legmagasabb, és ennél a mintánál tapasztaltuk a sejtszám legintenzívebb növekedését is. A tárolási kísérlet 7. napján már szignifikáns különbségek alakultak ki a minták vizsgálati eredményei között, ezek közül is az A-B minta tér el nagyságrendileg a Ny-B és MH-B mintáktól. A mérés 14. napján már mindhárom minta adata között nagyságrendnyi eltéréseket tapasztaltunk. Összcsíraszám tekintetében a MH-B minta esetében volt legalacsonyabb a sejtszám növekedés.

4.2.2. Élesztő/penész szám

Az élesztőszám eredményei (4. ábra) alapján megállapítottuk, hogy a nyers- és mikrohullámmal kezelt banános joghurtok esetében nincs számottevő különbség a minták telepszámainak, illetve a mikroorganizmusok szaporodási tendenciái tekintetében. Az aszalt almás joghurtok esetében azonban a sejtszám gyors növekedése volt jellemző, ami a termék organoleptikus tulajdonságait is befolyásolta. A mintavétel 7. napjától már szignifikáns különbségek alakultak ki a MH-B és Ny-B valamint a A-B és Ny-B minták között. A leghatékonyabbnak ebben az esetben is a mikrohullámú kezelés bizonyult.

A banános joghurtok esetében is vizsgáltuk a penészszám alakulását az eltarthatósági idő alatt. Az eredmények azt mutatták, hogy az első két mérés alkalmával, a 0. és a 7. napon a penésztelepek nem alakultak ki. A kísérlet 14. napján azonban az aszalt banános mintánál penészgombák jelentek meg 1,4*10⁴ CFU/cm³ mennyiségben, amely jóval meghaladja a rendelet szerinti megfelelőségi határértéket (102 CFU/cm3), sőt már a visszautasítási kategóriába esik (5*10³ CFU/cm³). A másik két minta (nyers és mikrohullámmal kezelt banán) esetében a 14. napon penészgombák nem voltak jelen. A kísérlet 21. napján a nyers banánnal kiegészített joghurtban is megjelentek a penészgombák 3,0*101 CFU/cm3 mennyiségben, amely még nem haladja meg a megfelelőségi határértéket. Az MH-B mintánál penészgomba még mindig nem volt kimutatható. A kísérlet 28. napján a penészgombaszám a nyers banános joghurt esetben is hozzávetőlegesen 1 nagyságrenddel meghaladta a visszautasítási határértéket. Az MH-B mintánál penészgomba még a 28. napon sem volt kimutatható.

Az aszalt termékek esetén kapott eredmények arra engednek következtetni, hogy a kíméletes hőkezeléssel végzett 24 órás aszalás nem javította kellő mértékben a felhasznált anyagok mikrobiológiai állapotát. Feltehető, hogy az aszalóberendezésen átáramló levegő higiéniai állapota sem volt megfelelő. Úgy véljük, hogy a joghurt készítményekhez előkészített gyümölcsök aszalását csak olyan helyiségben és berendezésben célszerű végezni, amelynek levegője kifogástalan, valamint elszívó és megfelelő légszűrőrendszerrel rendelkezik.

4.2.3. A joghurtok E. coli/coliform eredményei

Az Escherichia coli baktérium a normál bélflóra legfontosabb mikrobája, így minden melegvérű állat és az ember emésztőrendszerének természetes összetevője. Az élelmiszerekbe gyümölcsökről, zöldségekről kerülhet, ha azokat nem tisztították elég alaposan, de a nyers tejben vagy az abból készült tejtermékekben is előfordulhat.

A hatályos rendelet [28] alapján a fermentált tej, tejtermék, savanyított tejtermék, túró, túrókészítmények esetén a megfelelőség szint (m)<1/CFU/cm3 a visszautasítás határértéke (M)<10/CFU/cm³.

A kísérlet 0. és 7. napján elvégzett vizsgálatok alakalmával E. coli baktérium az általunk előállított minta egyikében sem volt kimutatható. A kísérlet 21. napján (3. hét) azonban a nyers banános és mikrohullámmal kezelt banános mintákon kívül az összes joghurtban kimutathatóvá vált a baktérium. A mérés 4. hetére az E. coli a nyers banános joghurtban is megjelent. Így a vizsgálat végére csak a mikrohullámmal kezelt banánnal kiegészített joghurt felelt meg a jogszabályi előírásoknak.

A coliform baktériumok megtalálhatók a vizes élőhelyeken, a talajban és a növényzeten; és általában nagy számban vannak jelen a melegvérű állatok székletében.

A hatályos – 4/1998. (XI. 11.) EüM – rendelet alapján a fermentált tej, tejtermék, savanyított tejtermék, túró, túrókészítmények esetén a megfelelőség szint (m)<10 CFU/cm³ a visszautasítás határértéke (M)<102 CFU/cm³.

A coliform baktériumokat a kísélrlet 0. napján az összes mintában kimutattuk, azonban a nem megfelelőségi határértéket csak az aszalt gyümölccsel kiegészített joghurtok mintáinak eredményei haladták meg. 1 hét elteltével azonban a coliformok csak az aszalt banános joghurt esetében voltak kimutathatók. Valószínűleg a joghurt pH értékének csökkenése akadályozta a baktériumok szaporodást és életben maradását.

A mérés 3. hetében a nyers gyümölccsel kiegészített mintáink esetében észleltünk coliform baktériumokat a többi mintában nem voltak jelen. Esetünkben a nyers gyümölccsel kiegészített minták elérték az M értéket, így 21 nap eltelte után a termékek nem voltak alkalmasak emberi fogyasztásra.

A mikrobiológiai vizsgálatok során a rendelet alapján előírt Salmonella és Staphylococcus aureus meghatározását is elvégeztük. Ezek a vizsgálatok minden esetben negatív eredményt hoztak.

Schnabel és munkatársai hétféle mikrobatörzzsel fertőzött meg (köztük az általunk vizsgaált E. coli baktériummal) nyers gyümölcsöket 10⁸ nagyságrendű sejtszámmal. Ezután mikrohullámmal támogatott plazmával kezelték a mintákat, amelynek hatására a sejtszámot már 5 perces kezelés után 4 nagyságrenddel volt képes csökkenteni. A kezelést non-termális körülmények között (30 °C-on) végezték, kizárva ezzel a hőmérséklet mikrobapusztító hatását [29].

Ez a jelenség munkacsoportunk mérései során abban nyilvánult meg, hogy az E. coli mikrohullámmal kezelt banános joghurtban a mérés 28. napjára sem volt kimutatható, szemben a nyers- és aszalt banános joghurtokkal. Ezzel szemben az almával kevert joghurtokban sajnos a kísérlet végére az E. coli jelenlétét észleltük.

Picouet és munkatársai kimutatták, hogy a mikrohullámú kezelések az E. coli O157: H7 és összcsíraszám értékeket hasonlóképpen befolyásolták, 1,01-1,16 log CFU g^-1 csökkenést detektáltak. Ugyanezen kezelési paraméterek nagymértékben befolyásolta az L. innocua-t, a populációk a kimutatási határ alatt voltak (10 CFU g^-1) a legtöbb esetben. Alma pürémintákban az összcsíraszám stabil maradt az 5 °C-on történő tárolás során, enyhe növekedéssel a 14. napon [30]. Ez a tendencia saját méréseink során is megfigyelhető volt. Eredményeink igazolják, hogy megvalósítottuk kutatásunk célkitűzését, amely a mikrohullámú kezelés mikrobapusztító és gátló hatásának igazolása volt.

Eredményeinket az is alátámasztja, hogy 5-25 másodperces (65 °C, 1200 W, 2,45 GHz) mikrohullámú kezelés képes zöldségek esetében a Salmonella sejtszámot 4-5 nagyságrenddel csökkenteni, ezzel is igazolható a mikrohullám többi kezeléshez viszonyított erősebb mikrobapusztító hatása [31].

5. Következtetések és javaslatok

A joghurtok ízesítő anyagaként felhasznált gyümölcsök esetében kétféle hőkezelést alkalmaztunk a termékek eltarthatóságának növelése érdekében. A mikrohullámú kezelési eljárás eltarthatóságra kifejtett hatását a hagyományos és kezeletlen gyümölcsök joghurtba való adagolása utáni eltarthatósági idő hosszával jellemeztük.

A mikrobiológia vizsgálatok alapján megállapítottuk, hogy a különböző hőkezelések közül a mikrohullámú kezelés volt a leghatékonyabb. A gyümölcsök hőkezelésének módszerei közül a mikrohullámú besugárzás eredményezett alacsonyabb csíraszámot a kezeletlen és az aszalásos technológiához képest.

A mikrobiológiai eredményeink alapján úgy véljük, hogy a nyers gyümölcs szennyezettsége vagy textúrája alapvetően befolyásolja a kezelés hatékonyságát. A banán mikrohullámú kezelése után a joghurtban kísérleteink végére (28. nap) sem volt kimutatható az E. coli baktérium jelenléte, szemben a kezelt alma esetében, ahol a 14. napon már kimutattuk annak jelenlétét. Ez azért lehet említésre méltó, mert a termék készítésének napján egyik esetben sem észleltük az E. coli jelenlétét. Feltételezhető, hogy a mikrohullámú sugárzás banán puha textúrájába intenzívebben fejtette ki csíraölő hatását, mint a keményebb konzisztenciájú alma esetében.

Megállapítottuk, hogy az aszalásos eljárás abban az esetben alkalmas mikrobiológiailag biztonságos élelmiszer előállítására, ha a berendezésben keringő levegő mikrobiológiai állapota is megfelelő.

Eredményeink alapján feltételezzük, hogy a mikrohullámú besugárzási technológia az élelmiszerek – jelen esetben gyümölcsök – esetében sikeresen alkalmazható az élelmiszerek belsejében, illetve felületén élő mikroorganizmusok gátlására.

Az almával ízesített joghurtok esetén a nyers gyümölcsös minták mikrobiológiai jellemzői voltak rosszabbak, ezekkel szemben a banán esetében az aszalásos technológia bizonyult mikrobiológiai szempontból a legkedvezőtlenebbnek. Ennek valószínű oka az lehet, hogy a banán az almával összehasonlítva átlagosan háromszor nagyobb mennyiségű szénhidrátot tartalmaz, amely az aszalás következtében koncentrálódott. A joghurtba kevert magas szénhidrát tartalmú gyümölcs pedig tápanyagként szolgálhatott a különböző mikroorganizmusok számára.

Annak érdekében, hogy megállapítsuk, hogy a mikrohullámban 55 °C-tól eltérő hőmérséklet, eltérő teljesítmény és kezelési időtartam alkalmazása eltarthatóság szempontjából kedvezőbb eredményeket hozna-e vagy sem, további vizsgálatok elvégzésére van szükség.

A hőkezelési eljárások közül a mikrohullám alkalmas lehet mind a tej kezelésére, így a mikrobaszám csökkentésére, mind pedig az alkalmazott ízesítőanyagok (fűszerek, gyümölcsök, zöldségek) csíraszámának csökkentésére.

6. Köszönetnyilvánítás

A publikáció elkészítését az EFOP-3.6.1-16-2016-00024 azonosítószámú „Intelligens szakosodást szolgáló fejlesztések az Állatorvostudományi Egyetem és a Széchenyi István Egyetem Mezőgazdaság- és Élelmiszertudományi Karának együttműködésében” című projekt támogatta. A projekt az Európai Unió támogatásával, az Európai Szociális Alap társfinanszírozásával valósult meg.

7. Irodalom

[1] Kukovics, S. (2009): A tej szerepe a humán táplálkozásban. Melánia Kiadó, Budapest.

[2] Coïsson, J.D., F. Travaglia, G. Piana, M. Capasso and M. Arlorio, (2005): Euterpe oleracea juice as a functional pigment for yogurt. Food Research International, 38 (8-9) pp. 893-897. https://doi.org/10.1016/j.foodres.2005.03.009

[3] Tamime, A.Y., Robinson. R.K. (1999): Yoghurt, Science and Technology. Cambridge, UK: Woodhead Publishing Limited. https://doi.org/10.1201/9780415876162

[4] Tarakci, Z., Kücüköner, E. (2003): Physical, chemical, microbiological and sensory characteristics of some fruit flavored yoghurt. Yüzüncü Yıl Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dergisi 14 (2) pp. 10-14.

[5] Deák, T. (2006): Élelmiszer mikrobiológia. Mezőgazda Kiadó, Budapest.

[6] Oms-Oliu G., Rojas-Grau M.A., Gonzalez L.A., Varela P., Soliva-Fortuny R., Hernando M.I.H., Munuera I.P., Fiszman S., & Martin-Belloso, O. (2010): Recent approaches using chemical treatments to preserve quality of fresh-cut fruit: A review. Postharvest Biology and Technology 57 (3) pp. 139-148. https://doi.org/10.1016/j.postharvbio.2010.04.001

[7] Pasha, I., Saeed, F., Sultan, M.T., Khan, M. R., & Rohi, M. (2014): Recent developments in minimal processing: A tool to retain nutritional quality of food. Critical Reviews in Food Science and Nutrition 54 (3) pp. 340-351. https://doi.org/10.1080/10408398.2011.585254

[8] Abadias, M., Usall, J., Anguera, M., Solsona, C., & Viñas, I. (2008): Microbiological quality of fresh, minimally-processed fruit and vegetables, and sprouts from retail establishments. International Journal of Food Microbiology, 123 (1-2) pp. 121-129. https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2007.12.013

[9] Johnston, L. M., Jaykus, L. A., Moll, D., Martinez, M. C., Anciso, J., Mora, B., & Moe, C. L. (2005): A field of study of the microbiological quality of fresh produce. Journal of Food Protection 68 (9) pp. 1840-1847. https://doi.org/10.4315/0362-028X-68.9.1840

[10] Lehto, M., Kuisma, R., Maatta, J., Kymalainen, H. R., & Maki, M. (2011). Hygienic level and surface contamination in fresh-cut vegetable production plants. Food Control 22 (3-4) pp. 469-475. https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2010.09.029

[11] Beuchat, L. R. (1998): Progress in conventional methods for detection and enumeration of foodborne yeasts. Food Technology and Biotechnology 36 (4) pp. 267-272.

[12] Magyar Élelmiszerkönyv (Codex Alimentarius Hungaricus): 2-51 számú irányelv, Tej és tejtermékek, Dairy products

[13] Vasbinder, A. J.; C. G. De Kruif. (2003): Casein-whey protein interactions in heated milk: the influence of pH. International Dairy Journal 13 (8) pp. 669-677. https://doi.org/10.1016/S0958-6946(03)00120-1

[14] Berecz, L. (1999): Élelmiszerek száradási jellemzői, különös tekintettel az élesztőkre, PhD disszertáció, Pannon Agrártudományi Egyetem, Mezőgazdaságtudományi Kar, Mosonmagyaróvár

[15] Tang, Z. W., Mikhaylenko, G., Liu, F., Mah, J.H., Pandit, R., Younce, F., Tang, J.M., (2008): Microwave sterilization of sliced beef in gravy in 7-oz trays. Journal of Food Engineering 89 (4) pp. 375-383. https://doi.org/10.1016/j.jfoodeng.2008.04.025

[16] Venkatesh, M.S., Raghavan, G.S.V., (2004): An overview of microwave processing and dielectric properties of agri-food materials. Biosystems Engineering 88 (1) pp. 1-18. https://doi.org/10.1016/j.biosystemseng.2004.01.007

[17] Pozar, M.D. (1993): Microwave Engineering, Addison-Wesley Publishing Company.

[18] Rosenberg, U., Bogl, W. (1987): Microwave pasteurization, sterilization, blanching, and pest control in the food industry. Food Technology 41 (6) pp. 92-99.

[19] Lau, M.H., Tang, J. (2002): Pasteurization of pickled asparagus using 915 MHz microwaves. Journal of Food Engineering 51 (4) pp. 283-290. https://doi.org/10.1016/S0260-8774(01)00069-3

[20] Wang, Y., Wig, T.D., Tang, J., Hallberg, L.M. (2003): Dielectric properties of foods relevant to RF and microwave pasteurization and sterilization. Journal of Food Engineering 57 (3) pp. 257-268 https://doi.org/10.1016/S0260-8774(02)00306-0

[21] Bennett, L.E., Jegasothy, H., Konczak, I., Frank, D., Sudharmarajan, S., Clingeleffer, P.R. (2011): Total polyphenolics and anti-oxidant properties of selected dried fruits and relationships to drying conditions. Journal of Functional Foods 3 (2) pp. 115-124. https://doi.org/10.1016/j.jff.2011.03.005

[22] Donno, D., Beccaro, G.L., Mellano, M.G., Cerutti, A.K., & Bounous G. (2015): Goji berry fruit (Lycium spp.): antioxidant compound fingerprint and bioactivity evaluation. Journal of Functional Foods 18 (B) pp. 1070-1085. https://doi.org/10.1016/j.jff.2014.05.020

[23] Hassan, A.N., Ipsen, R., Janzen, T., Qvist, K.B., (2003): Microstructure and rheology of yogurt made with cultures differing only in their ability to produce exopolysaccharides. Journal of Dairy Science 86 (5) pp. 1632-1638. https://doi.org/10.3168/jds.S0022-0302(03)73748-5

[24] Huang, L., Lu, Z., Yuan, Y., Lu, F., Bie, X., (2006): Optimization of a protective medium for enhancing the viability of freeze-dried Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus based on response surface methodology. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology 33 (1) pp. 55-61. https://doi.org/10.1007/s10295-005-0041-8

[25] Magyar Szabványügyi Testület (MSzT) (2014): Az élelmiszerlánc mikrobiológiája. Horizontális módszer a mikroorganizmusok számlálására. 1. rész: Telepszámlálás 30 °C-on lemezöntéses módszerrel Magyar Szabvány MSZ EN ISO 4833-1:2014. Magyar Szabványügyi Testület, Budapest.

[26] Magyar Szabványügyi Testület (MSzT) (1999): Mikrobiológia. Általános útmutató élesztők és penészek számlálásához. Telepszámlálási technika 25 °C-on. Magyar Szabvány MSZ ISO 7954:1999. Magyar Szabványügyi Testület, Budapest.

[27] Magyar Szabványügyi Testület (MSzT) (2014): Az Escherichia coli és coliform baktériumok megszámlálása. 2. rész: A legvalószínűbb szám módszere (EN ISO 9308-2:2014). Angol Szabvány MSZ EN ISO 9308-2:2014. Magyar Szabványügyi Testület, Budapest.

[28] 4/1998. (XI. 11.) EüM rendelet: Az élelmiszerekben előforduló mikrobiológiai szennyeződések megengedhető mértékéről (hatályos: 2020. 04. 02.)

[29] Schnabel, U., Niquet , R., Schlüter, O., Gniffke, H.; Ehlbeck, J. (2014): Decontamination and sensory properties of microbiologically contaminated fresh fruits and vegetables by microwave plasma processed air (PPA). Journal of Food Processing and Preservation 29 (6) pp. 1745-4549. https://doi.org/10.1111/jfpp.12273

[30] Picouet, P. A., Landl, A., Abadias, M., Castellari, M., Viñas, I. (2009): Minimal processing of a Granny Smith apple purée by microwave heating, Innovative Food Science and Emerging Technologies 10 (2009) pp. 545-550. https://doi.org/10.1016/j.ifset.2009.05.007

[31] Vega, M., López, S., Malo, L., Morales, S. (2012): Inactivation of Salmonella typhimurium in fresh vegetables using water-assisted microwave heating. Food Control 26 (1) pp. 19-22. https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2012.01.002

DOI: https://doi.org/10.52091/EVIK-2021/2-1-HUN

Érkezett: 2021. február – Elfogadva: 2021. április

^a Debreceni Egyetem, Mezőgazdaság-, Élelmiszertudományi és Környezetgazdálkodási Kar, Élelmiszertudományi Intézet
^b BIOMI Kft.
^c Pázmány Péter Katolikus Egyetem
^d WESSLING Hungary Kft.
^e Állatorvostudományi Egyetem
^* Levelező szerző: horvath.brigitta920108@gmail.com

Kulcsszavak

élelmiszer, Staphylococcus, antibiotikum rezisztencia, MALDI-TOF-MS, baktérium identifikálás, élelmiszerbiztonság, humán patogén, nozokómiás fertőzés

2. Bevezetés és irodalmi áttekintés

Az antibiotikum rezisztens mikroorganizmusok által okozott nozokómiális infekciók (kórházhigiénés fertőzések – a szerk.) száma minden országban növekedést mutat, ezáltal egyre nagyobb kihívás elé állítva az egészségügyi ellátórendszert [1, 2]. A helyzetet tovább súlyosbítja az a tény, hogy az antibiotikum rezisztens Staphylococcus fajok már nem csak a közösségekben és az egészségügyben, hanem az intenzív állattartásban, ezáltal az élelmiszerláncban is megjelentek [3].

A Staphylococcus fajokban az antibiotikum rezisztenciával és virulenciával kapcsolatos gének a mobilis genetikai elemekben (MGE) találhatók, mint például a kromószóma kazettákban, patogenitási szigeteken, plazmidokban vagy transzpozonokban [4]. A methicillinnel szembeni rezisztenciáért a mecA gén felelős: a gén egy módosított penicillin-kötő fehérjét kódol, amely csökkenti a legtöbb béta-laktám antibiotikum, így a penicillin és a methicillin kötődési affinitását. A mecA gén a Staphylococcus kromószóma kazettán (SSCmec) található, amely egy MGE csoport és csak a Staphylococcus fajokban található meg [5]. A mecA gén Staphylococcus fajok közötti átvitelének mechanizmusa nem ismert, azonban bizonyítékok támasztják alá a horizontális géntranszfert a koaguláz-pozitív és koaguláz-negatív Staphylococcus fajok között [6].

A methicillin-rezisztens Staphylococcus aureus (MRSA) törzsek élelmiszerláncban előforduló jelenlétéről már több tanulmány beszámolt. Szerzőik egy része állati eredetű élelmiszermintákból, másik része pedig nyers húsmintákból (sertés, hal, baromfi) izolált törzsek vizsgálatát végezte el. Hollandiában 2009-ben 2217 különböző élelmiszermintát vizsgáltak meg, amelynek a 12%-a MRSA törzsnek bizonyult [7], míg egy dániai vizsgálat során 153 sertéshúsmintának a 4,6%-a, az importált 173 sertéshúsmintának pedig a 7,5%-a volt fertőzött MRSA törzzsel [8]. Németországban nyers tejből, sertéshúsból, pulykahúsból és brojler csirkehúsból is azonosítottak MRSA törzseket [9]. Magyarországon egy tehenészeti telep 595 egyedi tejmintájából 27 db MRSA izolátumot azonosítottak [10], egy másik vizsgálatban 42 telep 626 S. aureus izolátuma közül csak 4 törzs bizonyult methicillin rezisztensnek [11]. Ezeken túl azonban más élelmiszerkategóriából származó és fogyasztásra kész élelmiszerekből eddig nem vizsgálták az MRSA jelenlétét. A törzsek molekuláris tipizálási eredményei rámutattak arra, hogy az MRSA számos típusa jelen van az élelmiszerláncban a különböző országokban [12], azonban a leggyakrabban a CC398-as típus fordult elő, amely az EU és az EGT területén a mezőgazdasági haszonállatokból izolált MRSA törzsek 85%-át teszi ki [13, 14, 7,15].

A további methicillin-rezisztens Staphylococcus (MRS) fajok előfordulását az élelmiszerekben azonban már kevesebb tanulmány vizsgálta. Nigériában 255 tradicionális ételből származó izolátumból 13 Staphylococcus faj (S. xylosus, S. epidermidis, S. simulans) mutatott methicillin-rezisztenciát [16]. Egy Lengyelországban végzett tanulmány során 58 készételből izolált törzsből 33 Staphylococcus törzs (S. epidermidis, S. simulans, S. xylosus, S. hycus, S. lentus, S. saprophyticus) mutatott rezisztenciát legalább egy fajta antibiotikummal szemben [17].

Az Európai Unióban az élelmiszerekből és haszonállatokból izolált Staphylococcus törzsek antibiotikum rezisztenciájának ellenőrzése jelenleg önkéntes, ezért 2016-ban csak Németország, Svájc, Dánia és Spanyolország jelentett ezzel kapcsolatos információt. Az MRSA előfordulási gyakorisága országonként eltérő volt, ám az összehasonlítás során figyelembe kell venni, hogy a vizsgálatokat eltérő állatfajokból, húsokból és húskészítményekből izolált törzseken végezték el [18]. A humán fertőzések kis hányada vezethető vissza a CC398-as típusú MRSA törzsekre és azok is legfőképp szakmai expozíciókra korlátozódnak, mint az állatgyógyászat és az intenzív állattartás. Ennek ellenére a CC398-as típusú MRSA törzsekben kimutatható virulencia faktorok lehetővé teszik a magas patogenitást, így a folyamatos revízió mind az állatokban, mind az élelmiszerekben elengedhetetlen [19]. A felügyelet szükségességét az egyéb Staphylococcus fajok antibiotikum rezisztenciájának esetleges fennállása is indokolja, amely lehetőséget nyújt a rezisztencia terjedésére, és veszélyt jelent a fogyasztók egészségére.

A sikeres felügyeleti rendszer elengedhetetlen feltétele, hogy egy egységes, gazdasági szempontból is elfogadható, gyors és megbízható módszer álljon rendelkezésre a mikroorganizmusok faji szintű azonosításában és antibiotikum rezisztencia meghatározásában, amelynek ígéretes alappillére lehet a fehérje azonosításon alapuló (peptide mass fingerprint) mátrix-asszisztált lézer deszorpciós, ionizációs, repülési idő mérésén alapuló tömegspektrometria (MALDI-TOF-MS). A 2000-es évek kezdetén számos tanulmány számolt be olyan specifikus fragment ionokról, amelyek lehetővé teszik az antibiotikum rezisztens Staphylococcus törzsek gyors azonosítását. A legtöbbet vizsgált biomarker a 2414 m/z értékű fragment ion volt, amelynek megjelenése a tömegspektrumban az MRSA törzsekre jellemző psm-mec expressziójával korrelál [20]. A detektáláshoz és diszkriminációhoz a 2414 m/z értékű fragment ion alkalmazhatóságát több tanulmány is igazolta [21, 22].

Az MRSA törzsek biomarkereinek vizsgálatain kívül más tanulmányok további Staphylococcus fajok methicillin-rezisztencia specifikus fragment ion csúcsait elemezték. Egy korábbi cikkben két specifikus fragment ion-értéket határoztak meg: a 7239 m/z értékű ion fragment-csúcsot, amely a methicillin-rezisztens S. epidermidis és a 9674 m/z fragment-ion csúcsot, amely a methicillin-rezisztens S. haemolyticus biomarkere [23].

Saját kísérleteink célja az élelmiszerekből izolált Staphylococcus törzsek methicillin rezisztenciájának vizsgálata klasszikus mikrobiológiai, molekuláris biológiai módszerekkel és MALDI-TOF-MS technikával, továbbá az antibiotikum rezisztens törzsek multilókusz szekvencia tipizálása volt (MLST) a törzsek epidemiológiai vizsgálata céljából.

3. Vizsgálati anyag és módszer

3.1. Gyűjtött izolátumok és tenyésztési körülmények

A WESSLING Hungary Kft. Mikrobiológiai laboratóriumában a 2019. augusztus és 2020. szeptember közötti időszakban az MSZ EN ISO 6888-1:2008 szabvány előírásai alapján izolált 77 Staphylococcus izolátumot vizsgáltunk. Az izolátumokat 37 °C-on, 24±1 órán keresztül Baird-Parker (Biokar, Franciaország) szelektív táptalajon tenyésztettük és a Staphylococcusokra jellemző kolóniákat Columbia véres agarra (Neogen, UK) oltottuk át (37 °C, 24±1 óra). A tenyésztés során 47 törzs mutatott pozitív koaguláz reakciót, míg 30 izolátum koaguláz-negatívnak bizonyult, amelyet latex agglutinációs gyorsteszttel (PASTOREX™ STAPH-PLUS) is igazoltunk. Az izolátumokat nyers húsból, húskészítményekből és fogyasztásra készételekből gyűjtöttük: baromfi (n=14), marha (n=5), sertés (n=42), vad (n=1), hal (n=1), tejtermék (n=3), készételek (n=3), zöldségek (n=2) és száraztészta (n=6).

3.2. Izolátumok azonosítása MALDI-TOF-MS technikával

A gyűjtött 77 izolátum azonosítását Bruker Microflex LT MALDI-TOF tömegspektrométerrel és a MALDI BioTyper 3.1 (Bruker Daltonics) szoftverrel végeztük el. Hangyasavas szuszpendálási protokollt alkalmaztunk, amely során Columbia véres agarról egy önálló telepet vettünk fel egy steril kacs segítségével, majd 40 µl hangyasavban szuszpendáltunk el. A szuszpenzióhoz 40 µl acetonitrilt adtunk, amelyből a lemez egyik pozíciójára 1 μl-t cseppentettünk fel. A csepp beszáradását követően a mintákra 1 μl α-HCCA (10 mg/ml α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid) mátrix oldatot vittünk fel és a mintát ismét hagytuk beszáradni. Valamennyi minta esetében 6 párhuzamos mérést végeztünk.

Az izolátumok azonosítása során MALDI Biotyper 3.1 szoftvert alkalmaztunk, amely a kapott tömegspektrumokat az adatbázisában szereplő referencia tömegspektrumokhoz hasonlítja és egy megfelelőségi faktort (score) számít ki. 2,300 – 3,000 log score érték esetén az azonosság igen valószínű. Ekkora log score érték esetén a faj azonosítottnak tekinthető. Amennyiben 2,000 – 2,299 közötti log score értéket kapunk, az azonosság kisebb, így ez esetben csak a mikroorganizmus nemzetsége tekinthető azonosítottnak. 1,700 – 1,999 log score érték között a nemzetség (genus) azonosítása sem tekinthető megfelelően biztosnak. Ha az értékelő szoftver 0,000 – 1,699 közötti log score értéket ad meg, az azonosítást sikertelennek kell tekinteni. A vizsgálatba bevont koaguláz-pozitív Staphylococcus törzsek azonosítását korábban végeztük el [24].

3.3. Antibiotikum érzékenységi vizsgálat

3.3.1. Methicillin-rezisztencia specifikus csúcsok vizsgálata MALDI-TOF-MS módszerrel

A kapott tömegspektrumokat a flexAnalysis 3.4 szoftverbe (Bruker Daltonics) exportáltuk és elvégeztük a tömegspektrumok manuális elemzését és összehasonlítását. A tömegspektrumok simítását a Savitzky–Golay szűrővel, az alapvonal korrekcióját pedig a TopHat algoritmussal végeztük el. Az elemzés során a methicillin-rezisztencia (MR) specifikus fragment ionok jelenlétét vizsgáltuk (1. táblázat).

3.3.2. Korongdiffúziós módszer

A törzsek antibiotikum-rezisztenciájának vizsgálata során a CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) által meghatározott előírásoknak (2019) megfelelően jártunk el [25]. A 0,5 McFarland egységnyi baktérium-szuszpenziót Mueller-Hinton agar (Oxoid, UK) felületére szélesztettük, majd a táptalaj felületére helyeztük a Cefoxitin 30 μg korongokat. A törzseket 37 °C-on, 18 órán át inkubáltuk. Az MRSA törzsek esetében a feltisztulási zóna referencia tartománya 6-19 mm volt, míg mecA negatív fajoknál 20-32 mm.

3.3.3. Szelektív differenciáló agar

Az antibiotikum rezisztencia vizsgálatok során továbbá a CHROMagar MRSAII szelektív differenciáló táptalajt (BD, UK) alkalmaztunk, amely a methicillin-rezisztens Staphylococcus aureus fajok kimutatására szolgál. Az izolátumokat 37 °C-on 24-48 órán keresztül inkubáltuk aerob körülmények között. MRSA baktériumnak tekintettük azokat a törzseket, amelyek morfológiailag Staphylococcusokhoz hasonló mályvaszínű telepeket képeztek. A korongdiffúziós (Cefoxitin 30 µg) módszert és az MRSA CHROMagar vizsgálatot minden élelmiszerből izolált törzs (n=77) esetében kétszer ismételtük meg. A vizsgálatok során pozitív kontrollként az ATCC 33591 referencia MRSA törzset, negatív kontrollként pedig az ATCC 29213 MSSA törzset használtuk.

3.3.4. mecA génkomplex

A mecA gén kimutatásának vizsgálatát a Dán Nemzeti Élelmiszertudományi Intézet (National Food Institute – NFI) 2012-ben kiadott protokollja alapján végeztük el [26]. A vizsgálat során pozitív kontrollként az ATCC 43300 MRSA törzset, míg negatív kontrollként az ATCC 29213 MSSA törzset használtuk. A baktériumokból genomi DNS-t izoláltunk, majd a mecA génszakaszt PCR segítségével felszaporítottuk. Az alkalmazott primereket a 2. táblázat tartalmazza.

3.4. A methicillin-rezisztens Staphylococcus törzsek MLST vizsgálata

THOMAS és munkatársai [27] tanulmánya alapján a baktériumokból genomi DNS-t izoláltunk, majd a 7 db Staphylococcus aureus fajra specifikus génszakaszt PCR segítségével felszaporítottuk (3. táblázat). Meghatároztuk a megtisztított PCR termékek nukleotid sorrendjét majd a szekvencia adatokat BioNumerics 7.6 szoftverben értékeltük.

4. Eredmények

4.1. Az izolált törzsek azonosítási eredményei

A MALDI-TOF-MS vizsgálat során minden koaguláz-pozitív Staphylococcus (CPS) törzs (n=47) S. aureus fajnak bizonyult (4. és 6. táblázat). A koaguláz-negatív Staphylococcus (CNS) törzsek esetében pedig 8 különböző fajt (S. xylosus, S. saprophyticus, S. pasteuri, S. epidermidis, S. warneri, S. chromogenes, S. piscifermentans, S. haemolyticus) azonosítottunk (4. és 7. táblázat). A CNS (n=30) izolátumok 30%-a S. warneri fajnak, míg 23%-a S. pasteuri fajnak bizonyult. A S. aureus törzsek 70%-át, míg a CNS törzsek mindegyikét hús és húskészítményekből izoláltuk (1. és 2. ábra). A S. aureus törzsek esetében a hús és húskészítmények 64%-a, míg a CNS törzsek 70%-a sertésből származott. A hús és húskészítményeken belül, a baromfiból és marhából származó izolátumok megoszlása közel azonos volt.

Az izolátumok átlag azonosítási log score értékeit és azok szórását a 4. táblázat foglalja össze. A S. aureus izolátumok átlag azonosítási log score értéke meghaladta a 2,400-et. A legalacsonyabb log score érték 2,304 volt, azonban még ebben az esetben is biztonságosnak tekinthető az azonosítás. A CNS izolátumok vizsgálata során, minden fajt 2,300 log score érték felett azonosítottunk és a szórás egyik esetben sem haladta meg a 0,1 értéket.

4.2. A MALDI-TOF-MS technikával meghatározott methicillin-rezisztencia eredményei

Az izolátumokból nyert tömegspektrumok elemzése során 3 antibiotikum-rezisztencia specifikus csúcsot vizsgáltunk meg. A 2414 m/z csúcs a mecA gén egyik fehérjeterméke [28], ezért ennek a csúcsnak a jelenlétét illetve hiányát minden törzs esetében megvizsgáltuk. A 7239 m/z csúcs detektálhatóságát csak a S. epidermidis fajokban, míg a 9674 m/z csúcs jelenlétét/hiányát csak a S. haemolyticus fajokban vizsgáltuk a csúcsok fajspecificitása miatt.

A 2414 m/z csúcsot a 77 izolátum közül, két S. aureus törzsben detektáltuk, amelyek közül az egyik libamájból (SA-17) a másik pedig sertés tarjából (SA-47) származik. A további 75 izolátum esetében ez a csúcs még alacsony intenzitással sem jelent meg (5. táblázat). Az elemzés során a methicillin-rezisztensnek bizonyult két S. aureus törzset pirossal, míg a többi, methicillin-rezisztencia specifikus csúcsot nem tartalmazó S. aureus törzsek tömegspektrumait feketével jelöltük (3. és 4. ábra).

A 7239 m/z egyik S. epidermidis törzsben (n=4) sem volt detektálható és a 9674 m/z csúcs a 4 S. haemolyticus faj egyikében sem jelent meg.

4.3. A korongdiffúziós módszer és az MRSA CHROMagar szelektív differenciáló agar eredményei

A 77 törzs vizsgálata során 75 törzs esetében a feltisztulási zóna átmérője 23-29 mm közé esett. Egy libamájból izolált törzs (SA-17) feltisztulási zónája 9 mm, egy sertéstarjából izolált törzs (SA-47) feltisztulási zónája pedig 17 mm átmérőjű volt és ugyanezen törzsek mályvaszínű telepeket képeztek az MRSA CHROMagar szelektív differenciáló táptalajon is (6. és 7. táblázat).

4.4. mecA gén kimutatás eredményei

A MALDI-TOF-MS vizsgálatok, a korongdiffúziós módszer és az MRSA szelektív, differenciáló táptalaj eredményei alapján kiderült, hogy a libamájból és sertés tarjából izolált S. aureus törzsek (SA-17, SA-47) methicillin-rezisztenciát hordoznak, amelyet a két törzsben kimutatható, a PBP2a szintéziséért felelős mecA gén erősített meg (6. táblázat).

4.5. Az MRSA törzsek MLST típusa

A vizsgálat során elvégeztük a két MRSA törzs MLST tipizálását is, amely során a PubMLST honlapon (https://pubmlst.org/saureus/) elérhető adatbázisban szereplő adatokat használtuk. A BioNumerics 7.6 szoftver a két MRSA törzs közül csak a sertés tarjából izolált törzs esetében tudta hozzárendelni a szekvencia típust.

A libamájból izolált törzs egy eddig még nem ismert szekvencia típusba, míg a sertés tarjából izolált törzs a 398-as szekvencia típusba tartozott (8. táblázat).

5. Összefoglalás és következtetés

A vizsgálat során különböző élelmiszer mátrixokból 77 Staphylococcus izolátumot gyűjtöttünk az MSZ EN ISO 6888-1:2008 szabványban leírt módszerek alapján. A szabvány ugyan lehetővé teszi a koaguláz-pozitív és koaguláz-negatív Staphylococcus fajok elkülönítését, azonban a faji identifikálást nem, amely a fajok eltérő virulencia faktorai és patogenitása szempontjából számottevő. Az élelmiszerekből izolált 47 koaguláz-pozitív és 30 koaguláz-negatív Staphylococcus törzs azonosítását MALDI-TOF-MS technikával végeztük el, magas azonosítási log score értékekkel. Emellett a kapott tömegspektrumok elemzésével, korábbi tanulmányokban meghatározott methicillin-rezisztencia specifikus ion fragment-értékek alapján két S. aureus törzs esetében methicillin-rezisztenciát állapítottunk meg, amelyet korongdiffúziós módszerrel, szelektív differenciáló agarral és a mecA gén kimutatásával igazoltunk. A specifikus ion fragment értékeknek köszönhetően jelentősen csökkenthető a diagnosztikai idő, amely gazdasági és terápiás szempontból sem elhanyagolható. Azt azonban figyelembe kell vennünk, hogy az MRSA törzsek nagy variabilitásának köszönhetően ezeknek az ion fragment értékeknek a szenzitivitása és specificitása nem 100%-os, így megerősítő vizsgálatok elvégzése szükséges.

Az élelmiszerekből izolált két MRSA törzsnek elvégeztük a multilókusz szekvencia tipizálását (MLST), a törzsek epidemiológiai vizsgálata céljából. A sertéshúsból származó izolátum az ST398 típusba tartozott, amely a mezőgazdasági haszonállatokból izolált MRSA törzsek leggyakoribb típusa az EU/EGT területén. Figyelembe véve azonban az ST398-as típusú törzsek specifikus gazdaszervezet adaptációs képességeit, miszerint azok nem csak sertésekben, hanem más állatfajokban és a humán szervezetben is képesek megtapadni, a kontamináció és a fertőződés számos módon létrejöhet az élelmiszer-feldolgozás technológiai lépései során is.

Tekintve, hogy az élelmiszerekből izolált 47 S. aureus törzs közül 2 törzs is methicillin-rezisztensnek bizonyult, e tény igazolja a globálisan növekvő antibiotikum-rezisztencia okozta veszélyeket, ezáltal a helyzet súlyosságát és aktualitását is jelzi.

6. Köszönetnyilvánítás

A tanulmány a WESSLING Hungary Kft., a BIOMI Kft. és az Innovációs és Technológiai Minisztérium ÚNKP-19-3-III kódszámú Új Nemzeti Kiválóság Programjának szakmai támogatásával készült.

7. Irodalom

[1] Böröcz, K. (2001): A magyarországi nosocomialis MRSA járványok tapasztalatai (1993-2000). Epidemiológiai Információs Hetilap. 8. (10-11).

[2] Böröcz, K. (2005): Az Országos tisztifőorvos állásfoglalása a methicillin-rezisztens Staphylococcus aureus (MRSA) törzsek által okozott, egészségügyi ellátással összefüggő fertőzések megelőzésükről és terjedésük megakadályozásáról. Epidemiológiai Információs Hetilap. 12. (5).

[3] Jungwhan, C., Kidon, S., Saeed, K. (2017): Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in Food-Producing and Companion Animals and Food Products. Frontiers in Staphylococcus aureus. Intechopen.

[4] Lim, D., Strynadka, N. C. J. (2002): Structural basis for the β-lactam resistance of PBP2a from metichillin-resistant Staphylococcus aureus. Nature Structural Biology. 9 (11), pp. 870-876. https://doi.org/10.1038/nsb858

[5] Ito, T., Katayama, Y., Hiramatsu, K. (1999): Cloning and nucleotide sequence determination of the entire mec DNA of pre-methicillin-resistant Staphylococcus aureus N315. Antimicrob Agents Chemother. 43 (6), pp. 1449-58. https://doi.org/10.1128/AAC.43.6.1449

[6] Wielders, C. L., Vriens, M. R., Brisse, S., De Graaf-Miltenburg, L. A., Troelstra, A., Fleer, A., Schmitz, F. J., Verhoef, J., Fluit, A. C. (2001): In-vivo transfer of mecA DNA to Staphylococcus aureus [corrected]. Lancet. 26; 357 (9269), pp. 1674-1675. https://doi.org/10.1016/S0140-6736(00)04832-7

[7] Köck, R., Harlizius, J., Bressan, N., Laerberg, R., Wieler, L. H., Witte, W., Deurenberg, R. H., Voss, A., Becker, K., Friedrich, A. W. (2009): Prevalence and Molecular Characteristics of Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA) Among Pigs on German Farms and Import of Livestock-Related MRSA Into Hospitals. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 28 (11), pp. 1375-1382. https://doi.org/10.1007/s10096-009-0795-4

[8] Agersø, Y., Hasman, H., Cavaco, L. M., Pedersen, K., Aarestrup, F. M. (2012): Study of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in Danish pigs at slaughter and in imported retail meat reveals a novel MRSA type in slaughter pigs. Veterinary Microbiology. 157 (1-2), pp. 246-250. https://doi.org/10.1016/j.vetmic.2011.12.023

[9] Argudín, M. A., Tenhagen, B. A., Fetsch, A., Sachsenröder, J., Käsbohrer, A. (2011): Virulence and resistance determinants of German Staphylococcus aureus ST398 isolates from nonhuman sources. Applied and Environmental Microbiology. 77 (9), pp. 3052-3060 https://doi.org/10.1128/AEM.02260-10

[10] Juhász-Kaszanyitzky, E., Jánosi, S., Somogyi, P., Dán, A., Van Der, A., Graaf-Van Bloois, L. (2007): MRSA transmission between cows and humans. Emerging Infectious Diseases. 13 (4), pp. 630-632. https://doi.org/10.3201/eid1304.060833

[11] Albert, E., Sipos, R., Jánosi, Sz., Kovács, P., Kenéz, Á., Micsinai, A., Noszály, Zs., Biksi, I. (2020): Occurrence and characterisation of methicillin-resistant Staphylococcus aureus isolated from bovine milk in Hungary. Acta Veterinaria Hungarica. 68 (3) pp. 236-241. https://doi.org/10.1556/004.2020.00040

[12] Wendlandt, S., Schwarz, S., Silley, P. (2013): Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus: A Food-Borne Pathogen? Annual Review of Food Science and Technology. 4, pp. 117-139. https://doi.org/10.1146/annurev-food-030212-182653

[13] Bosch, T., Verkade, E., Van Luit, M., Landman, F., Kluytmans, J., Schouls, L. M. (2015): Transmission andpersistence of livestock-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus among veterinarians and their household members. Applied and Environmental Microbiology. 81 (1), pp. 124-129. https://doi.org/10.1128/AEM.02803-14

[14] Fluit, A.C. (2012): Livestock-associated Staphylococcus aureus. Clinical Microbiology and Infection. 18 (8), pp. 735-744. https://doi.org/10.1111/j.1469-0691.2012.03846.x

[15] Verkade, E., Van Benthem, B., Den Bergh, M. K., Van Cleef, B., Van Rijen, M., Bosch, T., Kluytmans, J. (2013): Dynamics and determinants of Staphylococcus aureus carriage in livestock veterinarians: a prospective cohort study. Clinical Infectious Diseases. 57 (2), pp. 11-17. https://doi.org/10.1093/cid/cit228

[16] Fowoyo, P. T. - Ogunbanwo, S. T. (2017): Antimicrobial resistance in coagulase-negative staphylococci from Nigerian traditional fermented foods. Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials, 16 (4), pp. 2-7. https://doi.org/10.1186/s12941-017-0181-5

[17] Chaje, W., Zadernowska, A. C.-W., Nalepa, B., Sierpinska, M., - Łaniewska-Trokenheim, L. (2015): Coagulase-negative staphylococci (CoNS) isolated from ready-to-eat food of animal origin e Phenotypic and genotypic antibiotic resistance. Food Microbiology, 46, pp. 222-226. https://doi.org/10.1016/j.fm.2014.08.001

[18] European Food Safety Authority - EFSA (2018): The European Union summary report on antimicrobial resistance in zoonotic and indicator bacteria from humans, animals and food in 2016. EFSA journal. 16 (2), pp. 5182. https://doi.org/10.2903/j.efsa.2018.5182

[19] Aires-De-Sousa, M. (2016): Methicillin-resistant Staphylococcus aureus among animals: current overview. Clinical Microbiology and Infection. 23, pp. 373-380. https://doi.org/10.1016/j.cmi.2016.11.002

[20] Josten, M., Dischinger, J,. Szekat, C., Reif, M., Al-Sabti, N., Sahl, H. G., Parcina, M., Bekeredjian-Ding, I, Bierbaum, G. (2014): Identification of Agr-Positive Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus Harbouring the Class A Mec Complex by MALDI-TOF Mass Spectrometry. International Journal of Medical Microbiology. 304 (8), pp. 1018-1023. https://doi.org/10.1016/j.ijmm.2014.07.005

[21] Alksne, L., Makarova, S., Avsejenko, J., Cibrovska, A., Trofimova, J., Valciņa, O. (2020): Determination of methicillin-resistant Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis by MALDI-TOF-MS in clinical isolates from Latvia. Clinical Mass Spectrometry. 16, pp. 33-39. https://doi.org/10.1016/j.clinms.2020.03.001

[22] Pranada, A. B. - Bienia, M. - Kostrzewa, M. (2016): Optimization and Evaluation of MRSA Detection by Peak Analysis of MALDI-TOF Mass Spectra, in DGHM 2016 https://www.msacl.org/view_abstract/MSACL_2017_EU.php?id=305 Hozzáférés: 2021.01.08.

[23] Manukumar, H. M., Umesha, S. (2017): MALDI-TOF-MS based identification and molecular characterization of food associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Scientific Reports. 7, 11414 pp. 1-16. https://doi.org/10.1038/s41598-017-11597-z

[24] Horvath, B., Peles, F., Szél, A., Sipos, R., Erős, Á., Albert, E., Micsinai, A. (2020): Molecular typing of foodborne coagulase-positive Staphylococcus isolates identified by MALDI-TOF-MS. Acta Alimentaria, An International Journal of Food Science. 49 (3), pp. 307-313. https://doi.org/10.1556/066.2020.49.3.9

[25] Clinical and Laboratory Standards Institute - CLSI (2019): Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing: Eighteenth Informational Supplement M100- S18. Wayne, PA, USA: CLSI.

[26] National Food Institute - NFI (2012): protocol for pcr amplification of meca, mecc (mecalga251), spa and pvl recommended by the eurl-ar 2st version. https://www.eurl-ar.eu/CustomerData/Files/Folders/21-protocols/279_pcr-spa-pvl-meca-mecc-sept12.pdf Hozzáférés: 2021.02.03.

[27] Thomas, J. C., Vargas, M. R., Miragaia, M., Peacock, S. J., Archer, G. L., Enright, M. (2007): Improved Multilocus Sequence Typing Scheme for Staphylococcus epidermidis. Journal of Clinical Microbiology. 45 (2), pp. 616-619. https://doi.org/10.1128/JCM.01934-06

[28] Josten, M., Dischinger, J,. Szekat, C., Reif, M., Al-Sabti, N., Sahl, H. G., Parcina, M., Bekeredjian-Ding, I, Bierbaum, G. (2014): Identification of Agr-Positive Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus Harbouring the Class A Mec Complex by MALDI-TOF Mass Spectrometry. International Journal of Medical Microbiology. 304 (8), pp. 1018-1023. https://doi.org/10.1016/j.ijmm.2014.07.005

DOI: https://doi.org/10.52091/EVIK-2021/2-3-HUN

Érkezett: 2020. július – Elfogadva: 2020. november

¹ Debreceni Egyetem, Mezőgazdaság-, Élelmiszertudományi és Környezetgazdálkodási Kar, Élelmiszertudományi Intézet
² Debreceni Egyetem, Mezőgazdaság-, Élelmiszertudományi és Környezetgazdálkodási Kar, Állattudományi, Biotechnológiai és Természetvédelmi Intézet, Állattenyésztési nem önálló Tanszék
³ Debreceni Egyetem, Állattenyésztési Tudományok Doktori Iskola

Kulcsszavak

laktációszám, laktáció stádium, tehéntej, tejmennyiség, tejösszetétel, mikrobiológia

2. Bevezetés

A tehéntejnek magas a tápértéke; többek között zsírokat, fehérjéket, szénhidrátokat, vitaminokat és ásványi anyagokat tartalmaz [1]. A tej összetételének vizsgálata a tejelő állományok higiéniai, táplálkozási és egészségügyi szempontjainak figyelemmel kísérésére céljából a tejgazdaságokban rutinszerű gyakorlat [2]. A tej összetételét számos tényező befolyásolhatja, többek között a laktációk száma, a laktáció stádiuma, az évszak, valamint a takarmányozási technológia is [3, 4, 5]. A tej összetétele tehát változhat a laktációk során, és a különböző környezeti tényezők kölcsönhatásainak eredményeként különbségek lehetnek különböző tejtermelő tehenészetek között is [6]. Dürr et al. szerint kiemelkedően fontos a tejhozamra és a tej összetételére vonatkozó eltérések okainak és következményeinek meghatározása érdekében adatbázisok létrehozása. Az adatbázisnak tartalmaznia kell ezen paraméterekre és a laktációkkal kapcsolatos eseményekre vonatkozó, egyedekre vonatkozó feljegyzéseket is [7].

A tej tápértéke, magas vízaktivitása és semleges pH-ja révén kitűnő táptalajként szolgál a különféle mikroorganizmusok számára, amelyek között patogén szervezetek is előfordulhatnak, például Campylobacter jejuni, Salmonella spp., Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Yersinia enterocolitica stb. [8, 9]. A tej elsődleges fertőződése során maguk a beteg állatok a fertőződés forrásai. A szisztémás, kórokozók szóródásával járó betegségben szenvedő tejelő állatok esetében a kórokozók ugyanis kiválasztódhatnak a tejjel. A másodlagos szennyeződéskor a tej kontaminációja környezeti eredetű. A helytelen fejési higiénia miatt a tej többek között az állatok bélsarától, illetve a fejéskor alkalmazott eszközöktől (fejőgépek, tejvezetékek, tejtároló tartályok) szennyeződhet [10]. Ahogy a tej a tejmedencébe, majd a bimbócsatornába kerül, különböző környezeti eredetű mikroorganizmussal fertőződhet, ezért az első tejsugarak baktérium-fertőzöttsége kiemelkedően magas. A fejés megkezdésekor célszerű ezért az első tejsugarakat a továbbiakban fejt tejtől elválasztani, majd annak megsemmisítéséről gondoskodni kell [11]. A tejben lévő baktériumszám csökkentésére leginkább hőkezelést alkalmaznak. A tej kezdeti mikrobiológiai állapota nemcsak az élelmiszer-biztonság szempontjából fontos, de befolyásolhatja az abból készült tejtermékek minőségét is [12].

A coliform baktériumok tőgygyulladást idézhetnek elő a tejtermelő állatokban. A coliform baktériumok által okozott tőgygyulladás csökkentheti a tejelő állatok tejtermelését, gazdasági veszteségeket okozva ezzel a tejtermelő telepeknek [13]. Ezeknek a baktériumoknak a jelenléte a környezetben általános, ezért jelenlétük az élelmiszerben környezeti szennyeződésre utalhat [14, 15].

A nyerstej számos forrásból szennyeződhet S. aureus-szal, például a környezetből, a fejők kezéről, fejőberendezésekről stb. [16]. A S. aureus okozta tőgygyulladás gazdasági kára abból következik, hogy a termelt tej mennyisége lecsökken, minősége leromlik, a benne mért szomatikus sejtszám megnövekszik, a gyengébb minőségű tej felvásárlási ára csökken, így a tejtermelők árbevétele is csökken [17]. A S. aureus elleni védekezés hatékony eszköze a megelőzés. A fertőződés a megfelelő tartási és fejési technológia betartásával, a gyakoribb légyirtással, a tőgybimbó elő- és utófertőtlenítésével, az egyszer használatos tőgytörlő papírok használatával és a laborvizsgálatok rendszeres elvégzésével előzhető meg [18].

A külső és belső tényezők a tej összetételét, és a nyerstej mikrobiológiai állapotát is befolyásolhatják. Utóbbit leginkább a tejjel közvetlenül érintkező felületek higiéniai állapota határozza meg [19]. Peles és munkatársai kutatásai során arra a megállapításra jutottak, hogy a különböző tehénlétszámú tejtermelő gazdaságokban a különféle tartási és fejési módszerek befolyásoló hatást gyakorolnak a tej mikrobiológiai minőségére [20]. Tessema a fajta, az állatok kora, a laktáció száma és a laktáció stádiuma, valamint a S. aureus előfordulásának a valószínűsége között keresett összefüggést.

Tanulmányában a két vizsgált szarvasmarhafajta esetében jelentős különbséget tapasztalt a S. aureus tejben való előfordulására vonatkozóan. A S. aureus nagyobb arányban fordult elő a keresztezett teheneknél, illetve az idősebb egyedek esetében [21]. Bytyqi és munkatársai a különböző fajták tejét vizsgálva nem tapasztaltak különbséget a kapott telepszámok között [22].

Bár magyar tanulmány kevesebb számban készült a témában, több külföldi közleményben vizsgálták, hogy vajon a laktációk száma, laktációk stádiuma befolyással van-e az állatok napi tejmennyiségére, a tej összetételére és mikrobiológiai paramétereire. Tessema szerint a S. aureus prevalenciájában jelentős különbség figyelhető meg aszerint, hogy az állatok hányadik laktációjukban vannak. Tanulmányában megállapította, hogy a S. aureus azoknál a több mint kétszer ellett tehenek tejében fordult elő gyakrabban, amelyek a California Mastitis Test-tel pozitívak voltak [21]. Tenhagen és munkatársai is úgy találták, hogy a S. aureus előfordulásának gyakorisága nő az állatok korával [23]. Ez összefüggésben állhat azzal, hogy a fejések alkalmával a fejőgép megsértheti a tőgybimbókat, így mikroorganizmusok kerülhetnek a környezetből a tőgybe [24]. Egy másik lehetséges ok az, hogy a tejelő állatok egészségügyi állapota azok életkora előrehaladtával romolhat, amelynek kedvezőtlen hatása lehet a tej szomatikus sejtszámára [25].

Vizsgálataink során a célunk az volt, hogy egy hazai nagyüzemi tejtermelő telepen megállapítsuk, hogy van-e különbség az egyszer és a többször ellett, valamint a laktáció különböző stádiumaiban lévő tehenek napi tejmennyiségében, illetve az egyszer és a többször ellett, valamint a laktáció különböző stádiumaiban lévő tehenektől származó tej összetételében (zsír- és fehérjetartalom) és mikrobiológiai paramétereiben (szomatikus sejtszám, összcsíraszám, coliform- és S. aureus-szám).

3. Anyag és módszer

3.1. A mintavétel helye és ideje

Vizsgálatainkba egy Hajdú-Bihar megyében (Magyarország) található tejtermelő telepet vontunk be. A telepen 440–450 holstein-fríz tehenet fejnek. A telepen mélyalmos tartásmódot és monodiétás takarmányozást alkalmaznak. A fejés fejőházban történik, a fejést követően nem végeznek utófertőtlenítést.

A számításokhoz felhasznált napi tejmennyiségre, zsír- és fehérjetartalomra, szomatikus sejtszámra vonatkozó adatok a befejési eredményekből, azaz az Állattenyésztési Teljesítményvizsgáló Kft. által havonta gyűjtött tejminták vizsgálati eredményeiből, a befejési eredményekből származnak. A számításokba 38 egyed valamennyi 2015. május-2020. január közötti befejési eredményét felhasználtuk. A számítások során összegeztük az említett időintervallum alatt a tehenek első laktációjára vonatkozó adatait (n=387), a tehenek 2-5. laktációjára vonatkozó adatait (n=446), továbbá a tehenek laktációjának korai stádiumára (100 nap alatt; n=275), közép stádiumára (100-200 nap; n=249) és a késői stádiumára (200 nap felett; n=309) vonatkozó adatokat.

A mikrobiológiai vizsgálatokat 2018. május és 2019. október között végeztük. A mikrobiológiai vizsgálatokhoz 38 véletlenszerűen kiválasztott, klinikailag egészséges egyedtől összesen 62 tejmintát vettünk. Aszerint, hogy a mintavétel során az állatok hányadik laktációs ciklusban, illetve a laktáció amely stádiumában voltak, a következő csoportokba soroltuk az egyedektől vett mintákat: a 15 egyszer ellett tehéntől 26 mintát, a 23 többször ellett (2-5 ellés) holstein-fríz tehéntől 36 mintát vettünk. Az összesen vett 62 mintából 23-t a laktáció korai stádiumában, 21 mintát a laktáció közép stádiumában, 18 mintát pedig a laktáció végén tartó tehenektől vettünk.

A tőgybimbók előfertőtlenítését, papírtörlővel való szárazra törlését és az első tejsugarak kifejését követően a tehenek mind a négy tőgynegyedéből 50 ml űrtartalmú, zárható steril műanyag mintavételi edényekbe vettünk mintákat. Az edényeket a mintavételt követő két órán belül hűtőtáskában szállítottuk a Debreceni Egyetem Élelmiszertudományi Intézet mikrobiológiai laboratóriumába. A mintákat a mintavételtől számított 24 órán belül feldolgoztuk.

3.2. Mikrobiológiai vizsgálatok

A tejminták előkészítését és az azt követő mikrobiológiai vizsgálatokat Petróczki és munkatársai által leírt eljárás szerint végeztük el [26]. A mintaelőkészítés az MSZ EN ISO 6887-1:2017 [27] szabvány alapján történt, a mintákat a vizsgálat kezdetéig 4 °C-on tároltuk, feldolgozásuk előtt pedig rázással homogenizáltuk. A hígítási sor elkészítéséhez peptonvizet használtunk, amelyet 8,5 g nátrium-klorid (VWR International Kft., Magyarország) és 1,0 g pepton (Merck Kft., Magyarország) 1000 ml desztillált vízben való feloldásával állítottunk elő.

A megfelelő mennyiségek (9-9 ml) kémcsőbe történő kimérését követően a hígítófolyadékot 30 percig 120 °C-on kuktában sterileztük, majd lehűtöttük, végül elkészítettük a decimális hígítási sort.

Az összcsíraszám meghatározása az MSZ EN ISO 4833-1:2014 [28] szabvány szerint történt, amely tejporral kiegészített tripton-glükóz-élesztő (Plate Count Agar, PCA) agar táptalaj (Biolab Zrt., Magyarország) használatát írja elő. Az előírt lemezöntéses módszer végrehajtása után a lemezeket 72 órán át 30 °C-on inkubáltuk.

A coliform baktériumok mennyiségének meghatározását az ISO 4832:2006 [29] szabvány szerint lemezöntéses módszerrel végeztük, steril kristályibolya-epe-laktóz (Violet Red Bile Lactose, VRBL) agart (Biolab Zrt., Magyarország) használatával. Az inkubálás 30 °C-on történt 24 órán át tartott.

A S. aureus meghatározását az MSZ EN ISO 6888-1:2008 [30] szabványnak megfelelően szélesztéses módszerrel hajtottuk végre, amelyhez tojássárga-tellurit emulzióval (LAB-KA Kft., Magyarország) kiegészített Baird-Parker agart (BPA) (Biolab Zrt., Magyarország) használtunk. Az inkubálás 37 °C-on 48 órán át tartott. A S. aureust a többi Staphylococcus fajtól latex agglutinációs teszt (Prolex Staph Xtra Kit, Ferol Kft., Magyarország) alkalmazásával különítettük el.

3.3. Statisztikai analízis

Vizsgálati eredményeink elemzéséhez, leíró statisztika kiszámításához, valamint a mikroorganizmusok mennyiségének logaritmikus transzformációjához, a t-tesztek és a varianciaanalízis elvégzéséhez az SPSS v.22.0 [31] szoftvert alkalmaztuk.

A laktáció-szám esetében a változók összehasonlítását párosítatlan t-próbával, illetve nem paraméteres Mann-Whitney teszttel végeztük, a laktáció-stádium esetében pedig az összehasonlítást egytényezős varianciaanalízissel, illetve nem paraméteres Kruskal-Wallis teszttel végeztük el. Mivel az összcsíraszám, a coliform-szám és a szomatikus sejtszám több esetben nem bizonyult normál eloszlású változónak, e paraméterek esetében logaritmikus transzformációt alkalmaztunk. A statisztikai elemzések során a P<0,05 értéket szignifikáns különbségnek értékeltük.

4. Eredmények

4.1. A laktációszám hatása a tejhozamra, a nyers tej összetételére és mikrobiológiai paramétereire

Az egyszer és a többször ellett tehenek napi tejmennyiségének és az általuk termelt tej zsír- és fehérjetartalmának, továbbá a szomatikus sejtszámának, összcsíraszámának, coliform- és S. aureus-számának átlag és szórásértékeit az 1. táblázat tartalmazza. A vizsgálatra kiválasztott teheneket laktációjuk (egyben ellésük) száma alapján az egyszer, illetve a többször ellett egyedek csoportjaiba soroltuk. Az egyszer ellett tehenek esetében az átlagos tejmennyiség 25,67 kg/nap volt, míg a többször ellett tehenek esetében 31,04 kg/nap. A különbség szignifikáns (P<0,05), ezzel saját kísérleteinkkel is megerősítettük Bondan és munkatársai, valamint Yang és munkatársai megállapítását, miszerint a többször ellett tehenek által leadott napi tejmennyiség több az egyszer ellett tehenekéhez képest [5, 32]. Gurmessa és Melaku keresztezett holstein-fríz tehenek esetében vizsgálták többek között az ellésszám befolyását a tejmennyiségre, azonban nem tapasztaltak különbséget az egyszer és a többször ellett tehenek napi tejmennyisége között [33]. Pratap és kutatócsoportja az egyszer és a többször ellett tehenek napi átlagos tejmennyiségét (6,43±1,39 és 5,89±2,37 l/nap) vizsgálva szintén nem tapasztalt különbséget [34].

A kutatómunkánk során kiválasztott tehenek első laktációja során a tej átlag zsírtartalma 3,74±0,40% volt, míg a kettő, vagy annál több laktáció során vett tejmintákban az átlag zsírtartalom 3,75±0,36% volt. A különbséget nem találtuk szignifikánsnak (P>0,05). Saját eredményeinkhez hasonlóan Gurmessa és Melaku, továbbá Pratap és munkatársai sem tapasztaltak különbséget az egyszer, illetve többször ellett, keresztezett holstein-fríz tehenek tejének átlag zsírtartalma között [33, 34]. Bondan és csoportja viszont azt tapasztalta, hogy a laktációszám befolyásolta a tej zsírtartalmát holstein-fríz tehenekben. Míg az első laktációs tehenek esetében a zsírtartalom 3,47±0,67% volt, a 2-3. laktációs tehenek esetében, valamint a legalább négyszer ellett tehenek esetében 3,43±0,68% és 3,41±0,67% [5]. Shuiep és munkacsoportja a Szudánban készült tanulmányukban helyi és keresztezett tehenek esetében vizsgálták a tej zsírtartalmának változását a laktáció-számmal. A helyi tehenek esetében a negyedik laktációs (többször ellett) teheneknél alacsonyabb volt a tej zsírtartalma (4,82±0,55%), mint a kevesebbszer ellett (1:5,16±0,32; 2:5,22±0,34; 3:5,14±0,34) tehenek esetében. A keresztezett teheneknél nem tapasztaltak különbséget [6]. Yang és munkatársai a kutatásuk során ezzel szemben azt állapították meg, hogy az első laktációs holstein-fríz tehenek esetében volt kevesebb a tej zsírtartalma (3,88%) [32]. A tanulmányunk, illetve a más szakirodalmak változatos eredményei alapján arra a következtetésre jutottunk, hogy a laktációszámon kívül más egyéb tényező is befolyással lehet a tej zsírtartalmára.

Az általunk kiválasztott holstein-fríz tehenek első laktációja során a tej átlag fehérjetartalma 3,24±0,19%, míg a kettő, vagy annál több laktációjuk során vett tejmintákban az átlag fehérjetartalom 3,31±0,16% volt, a különbség nem jelentős (P>0,05). Ez egybevág Gurmessa és Melaku, valamint Pratap és munkatársai megállapításaival, ugyanis a szerzők sem tapasztaltak különbséget az egyszer, illetve többször ellett tehenek tejének átlag fehérjetartalma között [33, 34]. Bondan kutatócsoportja ezzel szemben úgy találta, hogy a laktációszám befolyásolta a tej fehérjetartalmát a holstein-fríz tehenekben. Míg az első laktációs tehenek esetében a fehérjetartalom 3,24±0,37% volt, a 2-3. laktációs tehenek esetében, valamint a legalább négyszer ellett tehenek esetében 3,23±0,38% és 3,19±0,37% [5]. A tej fehérjetartalmának változását a laktáció-számmal Shuiep kutatócsoportja is vizsgálta. A helyi tehenek esetében a negyedik laktációs (többször ellett) időszakba lépett teheneknél alacsonyabb volt a tej fehérjetartalma (3,67±0,19%), mint a kevesebbszer ellett (1:4,01±0,11; 2:3,82±0,12; 3:3,84±0,12) tehenek esetében. A keresztezett teheneknél nem tapasztaltak különbséget [6].

Eredményeink szerint az egyszer ellett tehenek tejében az átlag szomatikus sejtszám [242,2×10³ (5,12±0,42 lg) sejt/ml] kevesebb (P<0,05), mint a többször ellett tehenek tejében [356,3×10³ (5,39±0,39 lg) sejt/ml]. Az értékek átlagai egyik esetben sem haladták meg a 853/2004/EK rendeletben meghatározott határértéket [M=400,0×10³ (5,60 lg) tke/ml] [35]. A hazai tejtermelő telepen kapott eredmények egybevágnak a vonatkozó szakirodalmakkal.

Mikó és munkatársai szerint a laktáció számának növekedésével a tej szomatikus sejtszáma is növekedhet [25]. Ezt a megállapítást Yang és csoportja is tapasztalta [32]. Sheldrake és munkatársai szignifikáns kapcsolatot figyeltek meg az ellésszám és a szomatikus sejtszám között. Megállapították, hogy az ellések számának emelkedésével az egészséges állatok tőgynegyedeiben kisebb mértékű változás történt, azonban a S. aureus-szal fertőzött tőgynegyedek esetében jelentősen nőtt a szomatikus sejtszám [36]. Bondan kutatócsoportja az tapasztalta, hogy a vizsgált holstein tehenek laktációszámának növekedésével a tejben a szomatikus sejtszám is növekedő tendenciát mutatott. Míg az egyszer ellett tehenek esetében az átlag szomatikus sejtszám 4,83±1,73 lg sejt/ml volt, a két-háromszor ellett tehenek, valamint a négy, vagy annál többször ellett tehenek esetében 5,31±1,72 és 5,84±1,62 lg sejt/ml [5].

Az egyszer ellett, azaz első laktációs holstein-fríz tehenektől vett tejmintákban az átlag összcsíraszám 5,1×103 (3,36±0,58 lg) tke/ml volt és 4,6×103 (3,30±0,59 lg) tke ml a többször ellett tehenektől vett tejmintákban azonban a különbség nem volt szignifikáns (P>0,05).

A többször ellett tehenek tejében az átlag coliform-szám [1,1×103 (1,35±1,20 lg) tke/ml] viszont több (P<0,05) volt, mint az egyszer ellett tehenek tejében mért átlag telepszám [1,1×101 (0,65±0,61) lg) tke/ml]. Tenhagen és munkatársai szintén klinikailag egészséges teheneket vontak be a vizsgálatukba, amely során megállapították, hogy a coliform baktériumok bár nagyobb arányban fordultak elő a többször ellett tehenek tejében, nem volt tapasztalható különbség [23].

S. aureus a 26 közül csak egyetlen, egyszer ellett egyedtől származó tejmintában fordult elő, 5,0×10¹ (1,70 lg) tke/ml mennyiségben, a vizsgált 36 többször ellett egyedtől vett minta közül pedig nyolc egyedi tejmintában tudtuk kimutatni. Ezekben a mintákban az átlag S. aureus szám 1,5×10² (1,92±0,56 lg) tke/ml volt. Az értékek nem haladják meg a 4/1998 (XI. 11.) EüM rendeletben meghatározott határértéket [M=5,0×10² (2,70 lg) tke/ml] [37]. Azon egyedek esetében, amelyeknek tejében a mikrobiológiai vizsgálatok során kimutatható volt a S. aureus, a befejési adatok alapján az átlag szomatikus sejtszámuk 44,3×10³ (4,65 lg) sejt/ml és 357,2×103 (5,55 lg) sejt/ml között alakult. Tessema a tanulmányában szintén megállapította, hogy a S. aureus prevalenciája nagyobb a többször (azaz több mint kétszer) ellett tehenek (amelyek a California Mastitis Testtel pozitívak voltak) esetében [21]. Tenhagen és munkatársai szerint a S. aureus előfordulása növekedik az állatok életkorával és a laktáció stádiumával [23].

^{a, b} A táblázat azonos soraiban a különböző betűkkel jelölt értékek szignifikánsan különböznek (P<0,05)

4.2. A laktáció stádium hatása a tejhozamra, a nyers tej összetételére és mikrobiológiai paramétereire

A korai, közép és késői laktációs stádiumban lévő tehenek napi tejmennyiségének és az általuk termelt tej zsír- és fehérjetartalmának, továbbá a szomatikus sejtszámának, összes csíraszámának, coliform- és S. aureus-számának átlag és szórásértékeit a 2. táblázat tartalmazza. A vizsgálatra kiválasztott teheneket laktációjuk stádiuma alapján korai, közép és késői laktáció stádiumú egyedek csoportjaiba soroltuk. Az egyedek napi tejmennyiségének a laktáció stádiumával való változásának a vizsgálata során igazolódott az a szakirodalomban is megtalálható megállapítás, miszerint a laktáció vége felé haladva a napi leadott tejmennyiség csökken. Míg a laktációjuk elején lévő tehenek átlag napi tejmennyisége 32,10±4,73 kg/nap, a laktáció közepén tartó teheneké 29,08±5,09 kg/nap, a laktáció végén tartó teheneké 23,36±3,63 kg/nap. A különbség szignifikáns (P<0,05). Bondan és csoportja hasonló megállapításra jutottak a tanulmányukban. Az általuk vizsgált holstein-fríz tehenek laktációjának 6. és 60. nap közötti időszakában az átlagos tejmennyiség 29,4±8,72 l/tehén/nap volt; azon teheneknek, amelyek laktációjuk 61-120. napján tartottak 29,2±8,66 l/tehén/nap volt; a laktáció 121. és 220. napja közötti intervallumban a tehenek tejmennyisége 26,2±8,01 l/tehén/nap volt, a laktáció végén (>220 nap) pedig 22,0±7,49 l/tehén/nap [5].

Gurmessa és Melaku, valamint Pratap és munkatársai ugyancsak azt tapasztalták, hogy a laktáció elején nagyobb volt az állatok napi tejmennyisége (6,81±1,45 l/nap), mint a laktáció végén (5,48±0,05 l/nap). Vizsgálataik során a laktáció közepén tartó keresztezett holstein-fríz tehenek napi tejmennyisége (7,17±0,05 liter) volt a legnagyobb [33, 34]. Auldist és munkatársai szerint a laktáció-stádium tejmennyiségre gyakorolt hatása (például csökkenése) az emlőmirigyen belüli szekréciós sejtek számának és aktivitásának fiziológiai okból eredő változásából eredhet [2].

A vizsgált egyedek tejének zsírtartalma változást mutat a laktáció vége felé haladva. A laktáció elején, illetve közepén tartó tehenek tejének zsírtartalma átlagosan 3,65±0,43% és 3,59±0,41% volt, amelyek kevesebbnek (P<0,05) mutatkoztak, mint a laktáció végén járó tehenek tejében mért zsírtartalom (3,99±0,47%). A laktáció végén a tejzsír koncentrációjának növekedése összefüggésbe hozható a laktáció előrehaladásával tapasztalható tejhozam-csökkenéssel, ugyanis a csökkenő tejmennyiségnek koncentráló hatása lehet a tej összetételére nézve [2]. A tej zsírtartalma Gurmessa és Melaku közleménye szerint is változik az állatok laktációjának három stádiumában. A laktációjuk elején és végén tartó tehenek esetében a tej átlagos zsírtartalma (4,46±1,44% és 4,46±1,44%) jelentősen magasabb azon tehenek tejéhez (3,70±0,89%) képest, amelyek a laktáció közepén járnak [33]. Bondan és munkatársai közleményében az áll, hogy a tej zsírtartalma a laktáció végén (>200 nap) nagyobb (3,55±0,67%), mint a laktáció korábbi stádiumaiban. Ugyanakkor azt is tapasztalta, hogy a mért átlagos zsírtartalom (3,30±0,66%) a tehenek laktációjának 61. és 120. napja közötti időintervallumban volt a legkevesebb. A laktáció 6. és 60., valamint a 121. és 220. napjai közötti időintervallumában 3,40±0,65% és 3,40±0,66% átlag zsírtartalmat mértek [5]. Shuiep és munkatársai a szudáni helyi és keresztezett tehenek esetében vizsgálták a tej zsírtartalmának változását a laktáció stádiummal. A helyi fajta esetében nem volt különbség a zsírtartalmat illetően a laktáció elején (5,31±0,51%), közepén (4,67±1,56%) és végén (5,28±0,75%). A keresztezett teheneket tekintve azonban a laktáció végén több volt a zsírtartalom (4,45±1,43%), mint a laktáció elején (3,41±1,09%) és közepén (3,33±1,05%) [6].

A zsírtartalomhoz hasonlóan a fehérjetartalom esetében is változás figyelhető meg az időben a laktáció vége felé haladva. A laktáció elején mért átlagos fehérjetartalom 3,08±0,15%, a laktáció közepén 3,20±0,19%, a laktáció végén 3,56±0,20%, a különbség szignifikáns (P<0,05). Bondan és munkatársai hasonló megállapításra jutottak: a laktáció végén (>200 nap) nagyobb fehérjetartalmat (3,41±0,36%) mértek, mint a laktáció korábbi stádiumaiban. Azt is tapasztalták továbbá, hogy a mért átlagos fehérjetartalom (3,03±0,31%) a tehenek laktációjának 61. és 120. napja közötti időintervallumban volt a legkevesebb. A laktáció 6. és 60., valamint a 121. és 220. napok közötti időintervallumban 3,05±0,36% és 3,18±0,32% átlag fehérjetartalmat mértek [5]. Gurmessa és Melaku, valamint Pratap kutatócsoportja nem tapasztaltak különbséget a fehérjetartalmat illetően a laktáció elején (3,55±1,43%), közepén (3,17±0,15%) és végén (3,33±0,16%) lévő tehenek esetében [33, 34].Shuiep és munkatársai a szudáni helyi és keresztezett teheneket illetően vizsgálták a tej fehérjetartalmának változását a laktáció stádiummal. A helyi fajta esetében a laktáció elején (3,87±0,52%) és közepén (3,91±0,18%) több volt a fehérjetartalom az állatok tejében, mint a laktáció végén (3,67±0,17%). A keresztezett tehenek esetében nem volt különbség a zsírtartalmat illetően a laktáció elején (3,67±0,17%), közepén (3,69±0,16%) és végén (3,63±0,22%) [6].

A kutatómunkánk során kiválasztott tehenek laktációjának korai stádiumában az átlagos szomatikus sejtszám 195,1×103 (5,07±0,43 lg) sejt/ml, a laktáció közepén 370,6×103 (5,28±0,50 lg) sejt/ml, a késői laktációs stádiumban 336,4×103 (5,33±0,41 lg) sejt/ml volt. A késői laktációs stádiumban lévő egyedek tejében magasabb (P<0,05) volt a szomatikus sejtszám, mint a laktáció elején lévő tehenek esetében. A laktáció előrehaladásával a szomatikus sejtszám Bondan és munkatársai szerint is növekedő tendenciát mutat. Míg azon holstein-fríz tehenek tejében, amelyeknek laktációja 6. és 60. nap között tartott, az átlagos szomatikus sejtszám 4,79±1,90 lg sejt/ml volt, a laktáció 61. és 120. napja között 4,89±1,90 lg sejt/ml, a laktáció 121. és 220. napja között 5,21±1,75 lg sejt/ml, a 220. napnál tovább tartó laktáció esetében pedig ez a paraméter a vizsgált tehenek tejében 5,53±1,53 lg sejt/ml volt [5].

A holstein-fríz tehenek laktációjának stádiumaiban az összes csíraszámot is meghatároztuk. A laktáció elején az átlagos összes csíraszám 6,8×10³ (3,42±0,67 lg) tke/ml, a laktáció közepén 4,4×10³ (3,39±0,46 lg) tke/ml, a laktáció végén 2,7×10³ (3,13±0,56 lg) tke/ml volt. A kapott összes csíraszám-értékek között nem találtunk szignifikáns különbséget (P>0,05).

A coliform baktériumok számát illetően a legnagyobb telepszámot [1,3×10³ (1,30±1,23 lg) tke/ml] a tehenek laktációjának elején vett mintákból mértük, a legkevesebb átlagos coliform- számot [2,2×10¹ (0,76±0,79 lg) tke/ml] pedig a laktáció közepén vett mintákban mutattuk ki. A laktáció végén vett mintákban az átlagos coliform-szám 1,50×10² (0,90±0,94 lg) tke/ml volt. Az eredmények között nem tapasztaltunk szignifikáns különbséget (P>0,05).

S. aureus a 62 egyedi tejmintából összesen 9 (14,52%) mintában fordult elő átlagosan 1,4×10² (1,89±0,53 lg) tke/ml telepszámban. Abban a hat (9,68%) mintában, amelyek a laktációjuk elején tartó tehenektől származtak, az átlagos S. aureus-szám 1,2×10² (1,81±0,56 lg) tke/ml volt, a laktáció közepén lévő egy (1,61%) állat esetében a S. aureus szám 8,2×101 (1,91 lg) tke/ml volt, a laktáció végén lévő két (3,23%) tehén esetében pedig 2,4×10² (2,15±0,70 lg) tke/ml.

^{a, b, c} A táblázat azonos soraiban a különböző betűkkel jelölt értékek szignifikánsan különböznek (P<0,05)

5. Következtetések

Egy hazai tejgazdaságban végzett kutatómunkánk során igazoltuk, hogy nagyüzemi tartási körülmények között az egyszer ellett tehenek esetében az átlag napi tejmennyiség szignifikánsan kevesebb (P<0,05), mint a többször ellett tehenek esetében. Ennek valószínűleg az az oka, hogy testük fejlődéséhez az első laktációjukban lévő teheneknek van több aminosavra és zsírra szükségük a már több laktációs időszakon átesett állatokhoz képest [38].

A tej zsír- és fehérjetartalmát illetően nem volt szignifikáns különbség az egyszer és a többször ellett tehenek között. Mivel a szakirodalomban a tanulmányunkban kapott eredményekkel megegyező, illetve azoktól eltérő megállapításokkal is találkoztunk, feltételezzük, hogy más tényező (pl. fajta, évszak stb.) is befolyásolja a tej zsír- és fehérjetartalmát, azonban ezeknek a tényezőknek a feltérképezése nem képezte célját a tanulmányunknak. Shuiep és munkatársai közleményükben például két különböző szarvasmarhafajta esetében eltérő eredményekről számolnak be a tej zsír- és fehérjetartalmának a laktációszámmal történő változását vizsgálva [6].

Mérési eredményeink alapján megállapítottuk, hogy a többször ellett tehenektől vett tejmintákban az első laktációs tehenektől vett tejmintákhoz képest szignifikánsan nagyobb (P<0,05) volt a szomatikus sejtszám, illetve a coliform baktérium-szám, de a S. aureus is nagyobb arányban fordult elő. Annak oka, hogy a többször ellett tehenek esetében a mikroorganizmusok nagyobb mennyiségben mérhetők a tejmintákban, egyrészt valószínűleg az, hogy a tőgybimbók a laktációk során károsodhattak (többek között például a fejőgép miatt), amely növelhette a mikroorganizmusok tőgybe jutásának esélyét [24]. Másik oka az lehet, hogy a kor előrehaladtával, illetve a laktációk számának növekedésével a tejelő állatok kondíciója gyengülhetett, amely kedvezőtlenül hathatott például a tej szomatikus sejtszámára [25].

Azt is igazoltuk, hogy a laktáció stádiumaiban a napi leadott tejmennyiség esetén csökkenő tendenciát lehet megfigyelni, viszont a zsír- és fehérjetartalom növekedést mutat. Ez feltételezhetően a csökkenő tejmennyiség koncentráló hatásának tudható be.

A laktáció különböző stádiumaiból vett tejmintákban nem volt tapasztalható különbség az összes csíraszám és a coliform baktériumok telepszámait illetően, azonban a laktáció késői stádiumában a szomatikus sejtszám növekedést mutatott.

6. Köszönetnyilvánítás

A publikáció elkészítését az EFOP-3.6.3-VEKOP-16-2017-00008 számú projekt támogatta. A projekt az Európai Unió támogatásával, az Európai Szociális Alap társfinanszírozásával valósult meg.

Köszönettel tartozom a tejtermelő telep vezetőinek és dolgozóinak a segítőkész közreműködésükért.

7. Irodalom

[1] Hill B., Smythe B., Lindsay D., Shepherd J (2012): Microbiology of raw milk in New Zealand. International Journal of Food Microbiology 157 2 pp. 305-308. https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2012.03.031

[2] Auldist M. J., Walsh B. J., Thomson N. A. (1998): Seasonal and lactational influences on bovine milk composition in New Zealand. Journal of Dairy Research 65 (3) pp. 401-411. https://doi.org/10.1017/S0022029998002970

[3] Heck J. M. L., van Valenberg H. J. F., Dijkstra J., van Hooijdonk A. C. M. (2009): Seasonal variation in the Dutch bovine raw milk composition. Journal of Dairy Science 92 (10) pp. 4745-4755. https://doi.org/10.3168/jds.2009-2146

[4] Lambertz C., Sanker C., Gauly M. (2014): Climatic effects on milk production traits and somatic cell score in lactating Holstein-Friesian cows in different housing systems. Journal of Dairy Science 97 (1) 3 pp. 19-329. https://doi.org/10.3168/jds.2013-7217

[5] Bondan C., Folchini J. A., Noro M., Quadros D. L., Machado K. M., González F. H. D. (2018): Milk composition of Holstein cows: a retrospective study. Ciência Rural 48 (12) pp. 1-8. https://doi.org/10.1590/0103-8478cr20180123

[6] Shuiep E. S., Eltaher H. A., El Zubeir I. E. M. (2016): Effect of Stage of Lactation and order of Parity on Milk Composition and Daily Milk Yield among Local and Crossbred Cows in South Darfur State, Sudan. SUST Journal of Agricultural and Veterinary Sciences (SJAVS) 17 (2) pp. 86-99.

[7] Dürr J. W., Ribas N. P., Costa C. N., Horst J. A., Bondan C. (2011): Milk recording as an indispensable procedure to assure milk quality. Revista Brasileira Zootecnia 40 pp. 76-81.

[8] Quigley L., O’sullivan O., Beresford T. P., Ross R. P., Fitzgerald G. F., Cotter P. D. (2011): Molecular approaches to analysing the microbial composition of raw milk and raw milk cheese. International Journal of Food Microbiology 150 (2-3) pp. 81-94. https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2011.08.001

[9] Claeys W. I., Cardoen S., Daube G., De Block J., Dewettinck K., Dierick K., De Zutter L., Huyghebaert A., Imberechts H., Thiange P., Vandenplas Y., Herman L. (2013): Raw or heated cow milk composition: Review of risks and benefits. Food Control 31 (1) pp. 251-262. https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2012.09.035

[10] Laczay P., Lehel J., Lányi K., László N. (2016): A nyers tejben potenciálisan jelen levő kórokozók közegészségügyi jelentősége. Magyar Állatorvosok Lapja 138 pp. 231-242.

[11] Laczay P. (2008): Élelmiszer-higiénia - Élelmiszerlánc-biztonság. Mezőgazda Kiadó, Budapest.

[12] Cilliers F. P., Gouws P. A., Koutchma T., Engelbrecht Y., Adriaanse C., Swart P. (2014): A microbiological, biochemical, and sensory characterisation of bovine milk treated by heat and ultraviolet (UV) light for manufacturing Cheddar cheese. Innovative Food Science & Emerging Technologies 23 pp. 94-106. https://doi.org/10.1016/j.ifset.2014.03.005

[13] Mbuk E. U., Kwaga J. K. P., Bale J. O. O., Boro L. A., Umoh J. U. (2016): Coliform organisms associated with milk of cows with mastitis and their sensitivity to commonly available antibiotics in Kaduna State, Nigeria. Journal of Veterinary Medicine and Animal Health 8 (12) pp. 228-236. https://doi.org/10.5897/JVMAH2016.0522

[14] Altalhi A. D., Hassan S. A. (2009): Bacterial quality of raw milk investigated by Escherichia coli and isolates analysis for specific virulence-gene markers. Food Control 20 (10) pp. 913-917. https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2009.01.005

[15] Mhone T. A., Matope G., Saidi P. T. (2011): Aerobic bacterial, coliform, Escherichia coli and Staphylococcus aureus counts of raw and processed milk from selected smallholder dairy farms of Zimbabwe. International Journal of Food Microbiology 151 (2) pp. 223-228. https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2011.08.028

[16] Markus G. (2001): A tejelő tehenek tőgygyulladása III. MezőHír. 9

[17] Ózsvári L., Fux A., Illés B. CS., Bíró O. (2003): A Staphylococcus aureus tőgygyulladás által okozott gazdasági veszteségek számszerűsítése egy nagyüzemi holstein-fríz tehenészetben. Magyar Állatorvosok Lapja 125 pp. 579-584.

[18] Rosengren Å., Fabricius A., Guss B., Sylvén S., Lindqvist R (2010): Occurrence of foodborne pathogens and characterization of Staphylococcus aureus in cheese produced on farm-dairies. International Journal of Food Microbiology 144 (2) pp. 263-269. https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2010.10.004

[19] Anderson D., Dulmage D., McDougall M., Séguin G. (2003): General guidelines for effective dairy equipment cleaning. https://www.milk.org/Corporate/pdf/Farmers-UdderEquipmentCleaning.pdf (Hozzáférés: 21. 02. 2020.)

[20] Peles F., Máthéné Sz. Zs., Béri B., Szabó A. (2008): A tartástechnológia hatása a nyers tej mikrobiológiai állapotára. Agrártudományi Közlemények 31 pp. 67-75. https://doi.org/10.34101/actaagrar/31/3009

[21] Tessema F. (2016): Prevalence and Drug Resistance Patterns of Staphylococcus Aureus in Lactating Dairy Cow’s Milk in Wolayta Sodo, Ethiopia. EC Veterinary Science 2 (5) pp. 226-230.

[22] Bytyqi H., Vehapi I., Rexhepi S., Thaqi M., Sallahi D., Mehmeti I. (2013): Impact of Bacterial and Somatic Cells Content on Quality Fresh Milk in Small-Scale Dairy Farms in Kosovo. Food and Nutrition Sciences 4 (10) pp. 1014-1020. https://doi.org/10.4236/fns.2013.410132

[23] Tenhagen B. A., Köster G., Wallmann J., Heuwieser W. (2006): Prevalence of Mastitis Pathogens and Their Resistance Against Antimicrobial Agents in Dairy Cows in Brandenburg, Germany. Journal of Dairy Science 89 (7) pp. 2542-2551. https://doi.org/10.3168/jds.S0022-0302(06)72330-X

[24] Hamann J., Mein G. A., Wetzel S. (1993): Teat tissue reactions to milking: effects of vacuum level. Journal of Dairy Science 76 pp. 1040-1046. https://doi.org/10.3168/jds.S0022-0302(93)77432-9

[25] Mikó E., Baranyi A., Gráff M. (2015): Analysis of somatic cells in cow’s milk. Lucrări Ştiinţifice 17 (1) pp. 290-293.

[27] Magyar Szabványügyi Testület (MSzT) (2017): Élelmiszerek és takarmányok mikrobiológiája. A vizsgálati minták, az alapszuszpenzió és a decimális hígítások elkészítése mikrobiológiai vizsgálathoz. 1. rész: Az alapszuszpenzió és a decimális hígítások elkészítésének általános szabályai. Magyar szabvány MSZ EN ISO 6887-1:2017. Magyar Szabványügyi Testület, Budapest.

[26] Petróczki F. M., Tonamo T. A., Béri B., Peles F. (2019): The effect of breed and stage of lactation on the microbiological status of raw milk. Acta Agraria Debreceniensis 1 pp. 37-45. https://doi.org/10.34101/actaagrar/1/2367

[28] Magyar Szabványügyi Testület (MSzT) (2014): Az élelmiszerlánc mikrobiológiája. Horizontális módszer a mikroorganizmusok számlálására. 1. rész: Telepszámlálás 30 °C-on lemezöntés módszerrel. Magyar szabvány MSZ EN ISO 4833-1:2014. Magyar Szabványügyi Testület, Budapest.

[29] International Organization for Standardization (ISO) (2006): Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for the enumeration of coliforms - Colony-count technique. ISO 4832:2006

[30] Magyar Szabványügyi Testület (MSzT) (2008): Élelmiszerek és takarmányok mikrobiológiája. Horizontális módszer a koagulázpozitív sztafilokokkuszok (Staphylococcus aureus és más fajok) számának meghatározása. 1. rész: Baird-Parker-agar táptalajos eljárás. Magyar szabvány MSZ EN ISO 6888-1:2008. Magyar Szabványügyi Testület, Budapest.

[31] SPSS (2013): SPSS 22.0 for Windows. SPSS Inc., Chicago, IL, USA. Copyright © SPSS Inc., 1989-2013.

[32] Yang L., Yang Q., Yi M., Pang Z. H., Xiong B. H. (2013): Effects of seasonal change and parity on raw milk composition and related indices in Chinese Holstein cows in northern China. Journal of Dairy Science 96 (11) pp. 6863-6869. https://doi.org/10.3168/jds.2013-6846

[33] Gurmessa J., Melaku A. (2012): Effect of Lactation Stage, Pregnancy, Parity and Age on Yield and Major Components of Raw Milk in Bred Cross Holstein Friesian Cows. World Journal of Dairy & Food Sciences 7 (2) pp. 146-149.

[34] Pratap A., Verma D. K., Kumar P., & Singh A. (2014): Effect of Pregnancy, Lactation Stage, Parity and Age on Yield and Components of Raw Milk in Holstein Friesian Cows in organized Dairy form in Allahabad. IOSR Journal of Agriculture and Veterinary Science (IOSR-JAVS) 7 (2) pp. 112-115. https://doi.org/10.9790/2380-0721112115

[35] 853/2004/EK: Az Európai Parlament és a Tanács 853/2004/EK rendelete az állati eredetű élelmiszerek különleges higiéniai szabályainak megállapításáról

[36] Sheldrake R. F., Hoare R. J. T., McGregor G. D. (1983): Lactation Stage, Parity, and Infection Affecting Somatic Cells, Electrical Conductivity, and Serum Albumin in Milk. Journal of Dairy Science 66 pp. 542-547. https://doi.org/10.3168/jds.S0022-0302(83)81823-2

[37] 4/1998. (XI. 11.) EüM rendelet az élelmiszerekben előforduló mikrobiológiai szennyeződések megengedhető mértékéről

[38] Oltner R., Emanuelson M., Wiktorsson H. (1985): Urea concentrations in milk in relation to milk yield, live weight, lactation number and amount and composition of feed given to dairy cows. Livestock Production Science 12 (1) pp. 47-57. https://doi.org/10.1016/0301-6226(85)90039-9

DOI: https://doi.org/10.52091/EVIK-2021/2-4-HUN

Érkezett: 2020. július – Elfogadva: 2020. december

¹ Magyar Tejgazdasági Kísérleti Intézet Kft., Mosonmagyaróvár
² Széchenyi István Egyetem, Wittmann Antal Növény-, Állat- és Élelmiszer-tudományi Multidiszciplináris Doktori Iskola, Mosonmagyaróvár
³ Széchenyi István Egyetem, Mezőgazdaság- és Élelmiszertudományi Kar, Élelmiszertudományi Tanszék, Mosonmagyaróvár

Kulcsszavak

nozokomiális fertőzés, Serratia fajok, Serratia marcescens, patogén, prodigiozin, pigment, polimeráz láncreakció (PCR), élelmiszer-diagnosztika

2. Bevezetés és irodalmi áttekintés

Napjainkban az élelmiszerek kifogástalan minősége és hosszú eltarthatósági ideje a vásárlók által támasztott alapkövetelmény. Ennek megfelelően fokozódik az igény az egyre gyorsabb, pontosabb, megbízhatóbb élelmiszer-diagnosztikai eljárások iránt is. A molekuláris diagnosztikai módszerek ezzel összefüggésben mind nagyobb teret nyernek, például a kórokozó mikroorganizmusok gyors kimutatásában. Számos gyártó állít elő polimeráz láncreakción (PCR) alapuló, patogén mikrobák azonosítására alkalmas diagnosztikai kiteket, amelyeket sikerrel alkalmaznak magyarországi élelmiszervizsgáló laboratóriumokban is. Ezek a molekuláris biológiai tesztek főleg olyan mikrobák kimutatására alkalmasak, amelyek jelenléte nagy közegészségügyi kockázatot jelent (például Escherichia coli, Salmonella Typhimurium, Listeria spp.). Kisebb figyelem irányul azokra a kórokozókra, amelyek vizsgálatát jogszabály nem teszi kötelezővé. Ilyen mikróbák például a nyers és pasztőrözött tejben előforduló Serratia fajok is.

A Serratia fajok a környezetünkben sokfelé megtalálhatók [1]. Szaprofiták, illetve opportunista patogének [2]. Fakultatív anaerob, biofilmképző élőlények [1, 3]. A S. marcescens különösen jól szaporodik foszfortartalmú környezetben (például szappanok, samponok), és ellenáll egyes fertőtlenítőszereknek is [4, 5], így különböző nozokomiális betegségek okozója lehet [6, 7, 8]. A szakirodalom beszámol a S. marcescens fokozódó antibiotikum-rezisztenciájáról is [8, 9, 10]. A baktérium tehát könnyen túlél, szaporodik, így nem megfelelő higiénés körülmények között az élelmiszerekbe kerülhet. A fogyasztói tejbe is feltehetően a higiéniai szabályok áthágása következtében juthat, ott elszaporodik és többek között az élelmiszer minőségét is rontja [1, 11, 12]. A romlást némely faj esetén jellegzetes piros színárnyalat jelezi.

A magyarországi tejágazat esetében nem állnak rendelkezésre pontos adatok arról, hogy milyen mértékű a Serratia fajok, illetve a S. marcescens elterjedtsége, és hogy mely fajok okozzák a fertőzéseket, valamint rontják a tej minőségét. Arra vonatkozóan sincs hazai felmérés, hogy milyen mértékű a tejüzemek Serratia-szennyezettsége. Néhány publikációt leszámítva nemzetközi szinten is szegényesek a rendelkezésre álló információk a tejipar Serratia érintettségéről. Ilyen kivétel egy, a finn tejtermelő gazdaságokban tapasztalt, S. marcescens okozta tőgygyulladás-járványt bemutató tudományos cikk [1], valamint egy régebbi beszámoló, amely pigmentképző Serratia fajok masztitiszben játszott szerepét tárgyalja [13].

A tej piros elszíneződéséért a következő Serratia fajok lehetnek felelősek: S. marcescens, S. rubidaea, S. plymuthica és S. nematodiphila (1. táblázat). Előfordulási gyakoriságuk szerint a S. marcescens-nek van nagyobb jelentősége. Jellegzetes pigmentjük a vörös prodigiozin, amely vízben nem oldódó másodlagos anyagcseretermék, és amely meghatározott környezeti körülmények között termelődik [14, 15, 16, 17] (1. ábra). A táptalajon megjelenő tipikus piros telepek önmagukban még nem hordoznak elegendő információt a Serratia azonosításához, ugyanis számos egyéb, nem az enterobaktériumok közé tartozó nemzetség egyes fajai szintén termelhetnek prodigiozint [14, 18].

A Serratia fajok élelmiszerekből történő kimutatására ISO szabvány jelenleg nem áll rendelkezésre. Grimont és Grimont 2006-ban megjelent könyvfejezetében [9] foglalkozik a Serratia nemzetség jellemzőivel, az izolálás és az azonosítás szempontjaival is. A klasszikus mikrobiológiai módszerekkel történő azonosítás azonban meglehetősen körülményes, és a kísérőflóra gátló hatása miatt gyakran eredménytelen is, annak ellenére, hogy a tejminta rózsaszínes elszíneződése szemmel látható. A baktérium szelektív tenyésztésére elérhetők ugyan táptalajok [47], a gyakorlatban viszont ezek használata nem nyújt kielégítő megoldást. A hagyományos eljárások ráadásul idő- és munkaigényesek.

S. marcescens meghatározására létezik kereskedelmi forgalomban lévő gyorsmódszer, például a bioMérieux cég Rapid ID 32 E elnevezésű miniatürizált tesztkészlete, amely megfelel az ISO 7218 szabvány előírásainak [48]. A vizsgálat kivitelezéséhez azonban táptalajon felnövő telep szükséges. A kimutatás nehézségeinek kiküszöbölésére a már korábban említett, PCR módszeren alapuló diagnosztikai tesztek nyújthatnának megoldást. Jelenleg azonban egyedül a Primerdesign cég Genesig fantázianevű terméke említhető S. marcescens kimutatására alkalmas molekuláris diagnosztikai egységcsomagként [49].

Az élelmiszeripari és azon belül a tejipari vonatkozású szakirodalom meglehetősen szegényes a Serratia fajok és köztük S. marcescens végpont PCR vagy real-time PCR módszerrel történő kimutatásának témakörében. Hejazi és munkatársai [50] S. marcescens szerotipizálását végezték el RAPD-PCR technikával. Vizsgálataikhoz kórházi ellátásra szoruló páciensek szerológiai mintáit használták. Iwaya és munkatársai [6] szintén vérmintákat teszteltek S. marcescens törzsekre, real-time PCR módszert alkalmazva. Zhu és munkatársai [51] S. marcescens törzsek molekuláris jellemzését RFLP és PCR módszerrel végezték, míg Joyner és munkatársai [2] real-time PCR vizsgálattal detektáltak S. marcescens törzseket tengeri és egyéb vízi környezeti mintákból (például korall nyák, szivacs pórusvíz, üledék, csatornavíz, szennyvíz és hígított szennyvíz). Bussalleu és Althouse 2018-ben megjelent tanulmánya S. marcescens azonosítására alkalmas, hagyományos végpont PCR-technikáról számol be, amely hatékonyan detektálja a mikroorganizmus jelenlétét vaddisznó spermájában [52].

Célul tűztük ki S. marcescens tejből történő kimutatására alkalmas klasszikus PCR módszer beállítását. Munkánk jelentősége abban áll, hogy a szakirodalomban leírt, PCR vizsgálaton alapuló módszereket és alkalmazott primereket elemeztük, majd a megfelelőnek ítélt eljárást átültettük az élelmiszer-higiéniai vizsgálati gyakorlatba. Kísérleteinkben üzemi, nyers és pasztőrözött tejminták elszíneződésének a hátterében álló esetleges S. marcescens szennyeződés kvalitatív meghatározását végeztük.

3. Anyagok és módszerek

3.1. In silico vizsgálatok

Szakirodalmi közlések alapján kiválasztottunk három primerpárt (2. táblázat), amelyeket számítógépes modellezéssel, ún. in silico analízis során, valamint in vitro kísérletekben értékeltünk abból a célból, hogy a későbbi PCR vizsgálatok megvalósításához megtaláljuk a legalkalmasabbat.

In silico vizsgálatainkban a primer szekvenciák specifikusságát DNS-adatbázissal (NCBI BLAST) [54] történő összehasonlítás útján ellenőriztük. Az adatbázissal történő összevetés a homológia-keresést („blasztolás”) teszi lehetővé. Ezt követően a primerek megfelelőségét, azaz választott genomokon egy lehetséges PCR reakció megvalósulását, molekuláris biológiai szoftverrel (SnapGene 5.1.5.) teszteltük [55]. Az utóbbi esetben az NCBI adatbázisából letöltöttünk pozitív és negatív kontroll genomokat, majd a SnapGene szoftver alkalmazásával vizsgáltuk, hogy in silico módon a primerpárokkal megvalósulhat-e PCR reakció. A referenciának használt pozitív és negatív kontrollok teljes kromoszóma genomok voltak (3. táblázat).

* Primerek: A. Fpfs1 és Rpfs2; B. FluxS1 és RluxS2; C. Serratia2-for és Serratia2-rev.

Jelmagyarázat:

3.2. In vitro kísérletes vizsgálatok

Az in silico vizsgálatok megerősítéseként in vitro kísérleteket végeztünk, amelyek során a kiválasztott primerpárokat laboratóriumi PCR vizsgálatban teszteltük baktériumok (pozitív kontroll törzsként több S. marcescens, negatív kontroll törzsként pedig Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii, Streptococcus thermophilus, Enterococcus faecalis és Micrococcus luteus) választott törzseinek genomi DNS mintáján. A mikroorganizmusok az MTKI Kft. gyűjteményébe tartozó, üzemi környezetből származó, genetikai azonosítással meghatározott baktériumtörzsek voltak.

A PCR reakcióhoz szükséges komponensek összemérése során egy reakcióra 5,2 µL PCR tisztaságú steril vizet, 10 µL DreamTaq Green 2× PCR Master Mixet (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, Egyesült Államok), 0,4–0,4 µL (10 pmol/µl) primert és 4 µL izolált bakteriális genomi DNS-t használtunk. A reakciók negatív kontrollja PCR tisztaságú steril víz volt. A PCR berendezés (Mastercycler Nexus Gradient; Eppendorf International, Hamburg, Németország) programjának paraméterei a következőképpen alakultak: 95 °C 1 perc, majd 40 cikluson keresztül 95 °C 15 másodperc, 59,5 °C 15 másodperc, 72 °C 10 másodperc, végül 72 °C 7 perc [52].

A PCR reakció során képződött DNS szakaszok méret szerinti elválasztáshoz 10 µL mintát vizsgáltunk 2%-os agaróz gélben [TBE puffer (Tris-borate-EDTA) (10×), Thermo Fisher Scientific; Agarose DNA Pure Grade, VWR International, Debrecen, Magyarország; ECO Safe Nucleic Acid Staining Soluion 20.000×, Pacific Image Electronics, Torrance, Kalifornia, Egyesült Államok]. A DNS méretmarker a GeneRuler Low Range DNA Ladder (Thermo Fisher Scientific) volt. A géldokumentálás a Gel Doc Universal Hood II géldokumentációs berendezés és program (Bio-Rad, Hercules, Kalifornia, Egyesült Államok) alkalmazásával történt.

3.3. Nyers és pasztőrözött tejminták vizsgálata

Vizsgálatainkban egyrészt olyan, üzemi nyers és pasztőrözött tejmintákat alkalmaztunk, amelyek kapcsán felmerült a S. marcescens szennyeződés gyanúja azok rózsaszínes elszíneződése miatt. Másrészt teszteltünk az előbbiekkel együtt a laboratóriumba érkezett, elszíneződést azonban nem mutató, szintén üzemi nyers és pasztőrözött tejmintákat is.

A DNS-feltáró és -tisztító folyamathoz NucleoSpin Microbial DNA kitet (Macherey-Nagel, Düren, Németország) alkalmaztunk a gyártói előírások szerint. Az eluált DNS-t tartalmazó reakciócsöveket fagyasztóban tároltuk, -20 °C-on.

A következőkben 16S rDNS polimeráz láncreakcióval kontrolláltuk a DNS izolálás megfelelőségét és a minták amplifikálhatóságát, melyhez a 27f (5’-AGAGTTGATCMTGGCTCAG-3’) és 1492r (5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’) primert alkalmaztuk. A PCR reakció összemérési térfogata 1 mintára: 5,6 µL PCR tisztaságú steril víz, 10 µL DreamTaq Green 2× PCR Master Mix, 0,2–0,2 µL (10 pmol/µl) primerek és 4 µL izolált bakteriális genomi DNS. A reakció negatív kontrollja PCR minőségű steril víz volt. A PCR berendezés programjának paraméterei a következők voltak: 95 °C 4 perc, majd 40 cikluson keresztül 95 °C 20 másodperc, 54 °C 30 másodperc, 72 °C 1 perc, végül 72 °C 5 perc.

A PCR reakció során képződött DNS szakaszok elválasztáshoz 5 µL mintát vizsgáltunk 1%-os agaróz gélben. DNS méretmarker a GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder (Thermo Fisher Scientific) volt. A vizsgált DNS mintát további PCR vizsgálatra alkalmasnak értékeltük, amennyiben az amplifikált DNS fragment kópiáinak hossza a várt méret (~1500 bp) szerint alakult.

Következő lépésben a minták S. marcescens-specifikus PCR vizsgálata és a gélelektroforézis történt a 3.2. In vitro kísérletes vizsgálatok című alfejezetben ismertetett módon. Az eredményeket jelenlét-hiány elv alapján értékeltük.

A módszer megfelelőségének ellenőrzése céljából kontrollvizsgálatban tejminták PCR eredményeit hasonlítottuk össze a néhány esetben meglévő API (bioMérieux, Budapest, Magyarország) vizsgálat eredményeivel. A módszert ezt követően alkalmaztuk S. marcescens jelenlétének nyers és pasztőrözött tejekből történő kimutatására.

4. Eredmények

In silico vizsgálatainkban a primerek homológia vizsgálata során azok elsősorban S. marcescens kromoszóma genomokkal mutattak hasonlóságot. Találtunk azonban egyezést S. rubidaea és S. nematodiphila törzseknél és néhány nem Serratia fajnál is. Az eredményeket figyelembe vettük a SnapGene szoftveres vizsgálatainkhoz tervezett referencia genomok kiválasztásánál. További vizsgálat szükségességét indokolta, hogy a megfelelő homológia, a bázisok illeszkedése még nem jelenti automatikusan egy PCR reakció megvalósulását, mert például a primerek iránya, olvadási hőmérséklete és a képződő PCR termék mérete is meghatározó.

A SnapGene vizsgálatban PCR reakciókat a következő paraméterek mellett prediktáltunk: elemzéseinket legalább 15 bázis egyezése és eltérés (ún. single isolated mismatch) kizárása mellett végeztük. Az olvadási hőmérséklet (melting temperature) legkisebb értéke 50 °C, az amplifikáció eredményeképpen keletkezett fragmentum maximális hossza pedig 3 kbp volt.

Ahogy a 3. táblázatban látható, a Serratia2-for és Serratia2-rev primerpár S. marcescens genomokra illesztve minden esetben mutatott amplifikációt. A PCR reakció általában hat-hét amplikont is eredményezett a 16S rDNS szakaszokon. Az Fpfs1–Rpfs2 és a FluxS1–RluxS2 primerpárok tapadási helye a 16S rDNS-en kívül található a legtöbb S. marcescens törzsben, viszont néhány esetben nem mutattak in silico amplifikációt, érzékenységük tehát nem bizonyult megfelelőnek. A negatív kontroll genomoknál a Serratia2-for és Serratia2-rev primerpár néhány esetben PCR reakció lezajlását jelzi előre bizonyos S. rubidaea és S. nematodiphila törzseknél. Az Fpfs1–Rpfs2 primerek alkalmazásával a PCR reakció egy S. nematodiphila törzs esetén játszódna le. A FluxS1–RluxS2 primerek nem jelezték előre reakció lezajlását egyik választott negatív kontroll genomon sem (3. táblázat).

Az in vitro kísérletekben a pozitív kontrollnak választott S. marcescens genomokon mindhárom primerpár adott jelet a várt fragmentméret szerint, és egyik sem adott jelet a negatív kontrollokon. A Serratia2-for és Serratia2-rev primerpárral végzett vizsgálatot mutatja be a 2. ábra. A negatív mintáknál az 50 bp magasságban megjelenő gyenge jeleket a melléktermékként keletkező aspecifikus DNS darabok, a primer-dimerek felszaporodása okozza.

Az in silico analízisek és az in vitro vizsgálatok eredményei alapján további munkánkhoz a Serratia2-for és Serratia2-rev primereket ítéltük megfelelőnek, annak ellenére, hogy azok specifikussága nem tökéletes. A döntés alapja egyrészt a S. marcescens előfordulásának valószínűsíthető gyakorisága, másrészt a fals negatív vizsgálati eredmények elkerülésének a fontossága volt.

A beállított módszer megfelelőségét ellenőrizendő, kontroll vizsgálatban üzemi tejmintákat teszteltünk. A tejminták (n=10) közül néhány rózsaszínes elszíneződést mutatott. Vizsgálati módszerünkkel kilenc mintát pozitívnak ítéltünk a keresett mikrobára. A minták közül négy esetében API vizsgálati eredménnyel is rendelkeztünk. A négy API-pozitív minta a PCR vizsgálatban is pozitívnak bizonyult. A módszert ezt követően alkalmaztuk S. marcescens nyers és pasztőrözött tejekből történő kimutatására.

A tejminták egy része barackos-rózsaszínes elszíneződést mutatott (3. ábra), ez azonban számos esetben nem volt egyértelmű, a halvány vagy sárgásba hajló színárnyalat miatt. Összesen 60 minta vizsgálatát végeztük el. Ebből 32 db (53,3%) pozitív és 28 db (46,7%) negatív eredményt adott S. marcescens jelenlétére.

A 4. ábrán egyik vizsgálatunk eredményét, a gélelektroforézissel végzett elválasztás képét mutatjuk be. Jól látható, hogy a pozitív kontroll törzs pozitív, a negatív kontroll minta negatív jelet adott, mindemellett három vizsgálati minta esetében pozitív jelet kaptunk. A negatív mintáknál megjelenő gyenge jeleket ebben az esetben is a primer-dimerek felszaporodása okozta.

5. Megbeszélés

Eredményeink értékelésekor fontos figyelembe venni, hogy a PCR vizsgálat a mintában található cél DNS amplifikálására, detektálására alkalmas módszer, amelynek alapján nem lehet megállapítani, hogy az amplifikált S. marcescens-specifikus DNS vajon szaporodóképes, elpusztult, vagy ún. VBNC állapotú sejtekből származik-e. VBNC („viable but not culturable”) állapotban a sejtek életképesek, metabolikusan aktívak, viszont klasszikus, tenyésztéses módszerekkel nem szaporíthatók fel. Az állapot reverzibilis.

Munkánk célja S. marcescens kimutatását szolgáló klasszikus PCR módszer beállítása volt. Az alkalmazott vizsgálati eljárással elvégezhető a tejminták elszíneződésének hátterében álló S. marcescens szennyeződés kvalitatív meghatározása.

Noha itt bemutatott kísérleteinkben a pigmenttermelő S. marcescens kimutatására összpontosítottunk, egy jövőbeli, nemzetség-szintű vizsgálat során mind a 20 Serratia faj (1. táblázat) azonosítása megvalósulhatna. A többi Serratia faj detektálásának jelentőségét az adja, hogy jóllehet a Pseudomonas nemzetség a hűtött nyerstej romlásának legfőbb okozója, ismeretesek a Serratia fajok e tekintetben kimutatható veszélyei is [56]. Pseudomonas törzsekkel együtt ugyanis számos esetben Serratia törzseket is azonosítottak a tej romlásának okozóiként. A Serratia nemzetség tagjait kimutatták tejfeldolgozó üzemekben [3, 12], 4 °C-on tárolt nyerstej-mintákban [56, 57, 58] és tejtartályokban is [59]. Grimont és Grimont [9] már másfél évtizeddel ezelőtt megállapította, hogy a nyerstej-tételek esetenként Serratia fajokkal szennyeződhetnek, a tejtermékekben megjelenő leggyakoribb fajok pedig a S. liquefaciens és a S. grimesii.

A pszichrotróf Serratia fajok (például a S. liquefaciens) nyerstejben való előfordulása a hőkezelés után is minőségroimlást okozhat. Baglinière és munkatársai úgy találták, hogy a S. liquefaciens által termelt hőstabil Ser2 proteáz az UHT tej destabilizációjának jelentős tényezője lehet [11, 60].

Következtetésképpen megállapítható, hogy érdekes és hiánypótló kutatás lenne egy nemzetség-szintű vizsgálat, amelynek révén lehetőség nyílna a nyerstejek ilyen szempontú monitorozására, a Serratia fajok széleskörű detektálására. Az eredmények vélhetően nemcsak a tejgazdaság, tejipar szereplői számára nyújtanának hasznos információkat, hanem a hazai szabályozási és ellenőrzési gyakorlatra is hatással lehetnének.

6. Irodalom

[1] Friman, M.J., Eklund, M.H., Pitkälä, A.H., Rajala-Schultz, P.J., Rantala, M.H.J. (2019): Description of two Serratia marcescens associated mastitis outbreaks in Finnish dairy farms and a review of literature. Acta Veterinaria Scandinavica. 61, pp. 54. https://doi.org/10.1186/s13028-019-0488-7

[2] Joyner, J., Wanless, D., Sinigalliano, C.D., Lipp, E.K. (2014): Use of quantitative real-time PCR for direct detection of Serratia marcescens in marine and other aquatic environments. Applied and Environmental Microbiology. 80, pp. 1679-1683. https://doi.org/10.1128/AEM.02755-13

[3] Cleto, S., Matos, S., Kluskens, L., Vieira, M.J. (2012): Characterization of contaminants from a sanitized milk processing plant. PLoS ONE. 7(6), e40189. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0040189

[4] Langsrud, S., Møretrø, T., Sundheim, G. (2003): Characterization of Serratia marcescens surviving in disinfecting footbaths. Journal of Applied Microbiology. 95, pp. 186-195. https://doi.org/10.1046/j.1365-2672.2003.01968.x

[5] Møretrø, T., Langsrud, S. (2017): Residential bacteria on surfaces in the food industry and their implications for food safety and quality. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. 16, pp. 1022-1041. https://doi.org/10.1111/1541-4337.12283

[6] Iwaya, A., Nakagawa, S., Iwakura, N., Taneike, I., Kurihara, M., Kuwano, T., Gondaira, F., Endo, M., Hatakeyama, K., Yamamoto, T. (2005): Rapid and quantitative detection of blood Serratia marcescens by a real-time PCR assay: Its clinical application and evaluation in a mouse infection model. FEMS Microbiology Letters. 248, pp. 163-170. https://doi.org/10.1016/j.femsle.2005.05.041

[7] Bayramoglu, G., Buruk, K., Dinc, U., Mutlu, M., Yilmaz, G., Aslan, Y. (2011): Investigation of an outbreak of Serratia marcescens in a neonatal intensive care unit. Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 44, pp. 111-115. https://doi.org/10.1016/j.jmii.2010.02.002

[8] Moradigaravand, D., Boinett, C.J., Martin, V., Peacock, S.J., Parkhill, J. (2016): Recent independent emergence of multiple multidrug-resistant Serratia marcescens clones within the United Kingdom and Ireland. Genome Research. 26, pp. 1101-1109. https://doi.org/10.1101/gr.205245.116

[9] Grimont, F., Grimont, P.A.D. (2006): The genus Serratia. Prokaryotes. 6, pp. 219-244. https://doi.org/10.1007/0-387-30746-X_11

[10] Sandner-Miranda, L., Vinuesa, P., Cravioto, A., Morales-Espinosa, R. (2018): The genomic basis of intrinsic and acquired antibiotic resistance in the genus Serratia. Frontiers in Microbiology. 9, pp. 828. https://doi.org/10.3389/fmicb.2018.00828

[11] Baglinière, F., Tanguy, G., Salgado, R.L., Jardin, J., Rousseau, F., Robert, B., Harel-Oger, M., Dantas Vanetti, M.C., Gaucheron, F. (2017): Ser2 from Serratia liquefaciens L53: A new heat stable protease able to destabilize UHT milk during its storage. Food Chemistry. 229, pp. 104-110. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2017.02.054

[12] Salgado, C.A., Baglinière, F., Vanetti, M.C.D. (2020): Spoilage potential of a heat-stable lipase produced by Serratia liquefaciens isolated from cold raw milk. LWT - Food Science and Technology. 126, 109289. https://doi.org/10.1016/j.lwt.2020.109289

[13] Barnum, D.A., Thackeray, E.L., Fish, N.A. (1958): An outbreak of mastitis caused by Serratia marcescens. Canadian Journal of Comparative and Medical Veterinary Science. 22, pp. 392-395.

[14] Malik, K., Tokkas, J., Goyal, S. (2012): Microbial pigments: A review. International Journal of Microbial Resource Technology. 1 (4), pp. 361-365.

[15] Petersen, L.M., Tisa, L.S. (2013): Friend or foe? A review of the mechanisms that drive Serratia towards diverse lifestyles. Canadian Journal of Microbiology. 59, pp. 627-640. https://doi.org/10.1139/cjm-2013-0343

[16] Darshan, N., Manonmani, H.K. (2015): Prodigiosin and its potential applications. Journal of Food Science and Technology. 52, pp. 5393-5407. https://doi.org/10.1007/s13197-015-1740-4

[17] Srimathi, R., Priya, R., Nirmala, M., Malarvizhi, A. (2017): Isolation, identification, optimization of prodigiosin pigment produced by Serratia marcescens and its applications. International Journal of Latest Engineering and Management Research. 2 (9), pp. 11-21.

[18] Giri, A.V., Anandkumar, N., Muthukumaran, G., Pennathur, G. (2004): A novel medium for the enhanced cell growth and production of prodigiosin from Serratia marcescens isolated from soil. BMC Microbiology. 4, pp. 11. https://doi.org/10.1186/1471-2180-4-11

[19] Mahlen, S.D. (2011): Serratia infections: From military experiments to current practice. Clinical Microbiology Reviews. 24, pp. 755-791. https://doi.org/10.1128/CMR.00017-11

[20] Analyzer of Bio-resource Citations (2020): Microorganism Search for Paper, Patent, Genome and Nucleotic. http://abc.wfcc.info/index.jsp. Hozzáférés 2020.04.21.

[21] Birla Institute of Scientific Research, Bioinformatics Centre (2015): Database of Biochemical Tests of Pathogenic Enterobacteriaceae Family. https://bioinfo.bisr.res.in/cgi-bin/project/docter/serratia.cgi. Hozzáférés 2020.04.21.

[22] LPSN (2020): List of Prokaryotic Names with Standing in Nomenclature. https://lpsn.dsmz.de/genus/serratia. Hozzáférés 2020.04.21.

[23] Kämpfer, P., Glaeser, S.P. (2016): Serratia aquatilis sp. nov., isolated from drinking water systems. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 66, pp. 407-413. https://doi.org/10.1099/ijsem.0.000731

[24] Grimont, P.A.D., Jackson, T.A., Ageron, E., Noonan, M.J. (1988): Serratia entomophila sp. nov. associated with amber disease in the New Zealand grass grub Costelytra zealandica. International Journal of Systematic Bacteriology. 38, pp. 1-6. https://doi.org/10.1099/00207713-38-1-1

[25] Grimont, P.A.D., Grimont, F., Starr, M.P. (1979): Serratia ficaria sp. nov., a bacterial species associated with Smyrna figs and the fig wasp Blastophaga psenes. Current Microbiology. 2, pp. 277-282. https://doi.org/10.1007/BF02602859

[26] Anahory, T., Darbas, H., Ongaro, O., Jean-Pierre, H., Mion, P. (1998): Serratia ficaria: A misidentified or unidentified rare cause of human infections in fig tree culture zones. Journal of Clinical Microbiology. 36, pp. 3266-3272. https://doi.org/10.1128/JCM.36.11.3266-3272.1998

[27] Gavini, F., Ferragut, C., Izard, D., Trinel, P.A., Leclerc, H., Lefebvre, B., Mossel, D.A.A. (1979): Serratia fonticola, a new species from water. International Journal of Systematic Bacteriology. 29, pp. 92-101. https://doi.org/10.1099/00207713-29-2-92

[28] Grimont, P.A.D., Grimont, F., Irino, K. (1982): Biochemical characterization of Serratia liquefaciens sensu stricto, Serratia proteamaculans, and Serratia grimesii sp. nov.. Current Microbiology. 7, pp. 69-74. https://doi.org/10.1007/BF01568416

[29] Hennessy, R.C., Dichmann, S.I., Martens, H.J., Zervas, A., Stougaard, P. (2020): Serratia inhibens sp. nov., a new antifungal species isolated from potato (Solanum tuberosum). International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 70, pp. 4204-4211. https://doi.org/10.1099/ijsem.0.004270

[30] Bizio, B. (1823): Lettera di Bartolomeo Bizio al chiarissimo canonico Angelo Bellani sopra il fenomeno della polenta porporina. Biblioteca Italiana, o sia Giornale di Letteratura, Scienze, e Arti (Anno VIII). 30, pp. 275-295.

[31] Williams, R.P., Gott, C.L., Qadri, S.M.H., Scott, R.H. (1971): Influence of temperature of incubation and type of growth medium on pigmentation in Serratia marcescens. Journal of Bacteriology. 106, pp. 438-443. https://doi.org/10.1128/JB.106.2.438-443.1971

[32] Wang, J., Zheng, M.L., Jiao, J.Y., Wang, W.J., Li, S., Xiao, M., Chen, C., Qu, P.H., Li, W.J. (2019): Serratia microhaemolytica sp. nov., isolated from an artificial lake in Southern China. Antonie Van Leeuwenhoek. 112, pp. 1447-1456. https://doi.org/10.1007/s10482-019-01273-9

[33] García-Fraile, P., Chudíčková, M., Benada, O., Pikula, J., Kolařík, M. (2015): Serratia myotis sp. nov. and Serratia vespertilionis sp. nov., isolated from bats hibernating in caves. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 65, pp. 90-94. https://doi.org/10.1099/ijs.0.066407-0

[34] Zhang, C.X., Yang, S.Y., Xu, M.X., Sun, J., Liu, H., Liu, J.R., Liu, H., Kan, F., Sun, J., Lai, R., Zhang, K.Y. (2009): Serratia nematodiphila sp. nov., associated symbiotically with the entomopathogenic nematode Heterorhabditidoides chongmingensis (Rhabditida: Rhabditidae). International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 59, pp. 1603-1608. https://doi.org/10.1099/ijs.0.003871-0

[35] Grimont, P.A.D., Grimont, F., Richard, C., Davis, B.R., Steigerwalt, A.G., Brenner, D.J. (1978): Deoxyribonucleic acid relatedness between Serratia plymuthica and other Serratia species, with a description of Serratia odorifera sp. nov. (type strain: ICPB 3995). International Journal of Systematic Bacteriology. 28, pp. 453-463. https://doi.org/10.1099/00207713-28-4-453

[36] Van Houdt, R., Moons, P., Jansen, A., Vanoirbeek, K., Michiels, C.W. (2005): Genotypic and phenotypic characterization of a biofilm-forming Serratia plymuthica isolate from a raw vegetable processing line. FEMS Microbiology Letters. 246, pp. 265-272. https://doi.org/10.1016/j.femsle.2005.04.016

[37] Zhang, C.W., Zhang, J., Zhao, J.J., Zhao, X., Zhao, D.F., Yin, H.Q., Zhang, X.X. (2017): Serratia oryzae sp. nov., isolated from rice stems. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 67, pp. 2928-2933. https://doi.org/10.1099/ijsem.0.002049

[38] Lehman, K.B., Neumann, R. (1896): Atlas und Grundriss der Bakeriologie und Lehrbuch der Speziellen Bakteriologischen Diagnostik, Volume 11st Ed. J.F. Lehmann, München.

[39] Breed, R.S., Murray, E.G.D., Hitchens, A.P. (Eds.) (1948): Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 6th ed. Williams and Wilkins Co., Baltimore, MD, USA. pp. 1-1529.

[40] Paine, S.G., Stansfield, H. (1919): Studies in bacteriosis. III. A bacterial leaf spot disease of Peotea cynaroides, exhibiting a host reaction of possibly bacteriolytic nature. Annals of Applied Biology. 6, pp. 27-39. https://doi.org/10.1111/j.1744-7348.1919.tb05299.x

[41] Grimont, P.A.D., Grimont, F., Starr, M.P. (1978): Serratia proteamaculans (Paine and Stansfield) comb. nov., a senior subjective synonym of Serratia liquefaciens (Grimes and Hennerty) Bascomb et al. International Journal of Systematic Bacteriology. 28, pp. 503-510. https://doi.org/10.1099/00207713-28-4-503

[42] Ashelford, K.E., Fry, J.C., Bailey, M.J., Day, M.J. (2002): Characterization of Serratia isolates from soil, ecological implications and transfer of Serratia proteamaculans subsp. quinovora Grimont et al. 1982 to Serratia quinovorans corrig., sp. nov.. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 52, pp. 2281-2289. https://doi.org/10.1099/00207713-52-6-2281

[43] Stapp, C. (1940): Bacterium rubidaeum nov. spec. Zentralblatt für Bakteriologie, Parasitenkunde, Infektionskrankheiten und Hygiene, Abt. II. 102, pp. 252-260.

[44] Ewing, W.H., Davis, B.R., Fife, M.A., Lessel, E.F. (1973): Biochemical characterization of Serratia liquefaciens (Grimes and Hennerty) Bascomb et al. (formerly Enterobacter liquefaciens) and Serratia rubidaea (Stapp) comb. nov. and designation of type and neotype strains. International Journal of Systematic Bacteriology. 23, pp. 217-225. https://doi.org/10.1099/00207713-23-3-217

[45] Sabri, A., Leroy, P., Haubruge, E., Hance, T., Frère, I., Destain, J., Thonart, P. (2011): Isolation, pure culture and characterization of Serratia symbiotica sp. nov., the R-type of secondary endosymbiont of the black bean aphid Aphis fabae. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 61, pp. 2081-2088. https://doi.org/10.1099/ijs.0.024133-0

[46] Bhadra, B., Roy, P., Chakraborty, R. (2005): Serratia ureilytica sp. nov., a novel urea-utilizing species. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 55, pp. 2155-2158. https://doi.org/10.1099/ijs.0.63674-0

[47] Starr, M.P., Grimont, P.A.D., Grimont, F., Starr, P.B. (1976): Caprylate-thallous agar medium for selectively isolating Serratia and its utility in the clinical laboratory. Journal of Clinical Microbiology. 4, pp. 270-276.

[48] BioMérieux (2015): API & ID 32 Identification Databases. https://www.biomerieux-diagnostics.com/sites/clinic/files/9308960-002-gb-b-apiweb-booklet.pdf. Hozzáférés 2020.04.02.

[49] Primerdesign (2019): Serratia marcescens Genesig kit. https://www.genesig.com/products/9405-serratia-marcescens. Hozzáférés 2020.04.02.

[50] Hejazi, A., Keane, C.T., Falkiner, F.R. (1997): The use of RAPD-PCR as a typing method for Serratia marcescens. Journal of Medical Microbiology. 46, pp. 913-919. https://doi.org/10.1099/00222615-46-11-913

[51] Zhu, H., Zhou, W.Y., Xu, M., Shen, Y.L., Wei, D.Z. (2007): Molecular characterization of Serratia marcescens strains by RFLP and sequencing of PCR-amplified 16S rDNA and 16S-23S rDNA intergenic spacer. Letters in Applied Microbiology. 45. pp. 174-178. https://doi.org/10.1111/j.1472-765X.2007.02166.x

[52] Bussalleu, E., Althouse, G.C. (2018): A PCR detection method for discerning Serratia marcescens in extended boar semen. Journal of Microbiological Methods. 151, pp. 106-110. https://doi.org/10.1016/j.mimet.2018.06.012

[53] Zhu, H., Sun, S.J., Dang, H.Y. (2008): PCR detection of Serratia spp. using primers targeting pfs and luxS genes involved in AI-2-dependent quorum sensing. Current Microbiology. 57, pp. 326-330. https://doi.org/10.1007/s00284-008-9197-6

[54] National Center for Biotechnology Information (2020): Search database. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/. Hozzáférés 2020.03.20.

[55] Insightful Science (2020): SnapGene Software. https://www.snapgene.com/. Hozzáférés 2020.03.20.

[56] Machado, S.G., Baglinière, F., Marchand, S., Van Coillie, E., Vanetti, M.C.D., De Block, J., Heyndrick, M. (2017): The biodiversity of the microbiota producing heat-resistant enzymes responsible for spoilage in processed bovine milk and dairy products. Frontiers in Microbiology. 8, p. 302. https://doi.org/10.3389/fmicb.2017.00302

[57] Lafarge, V., Ogier, J.C., Girard, V., Maladen, V., Leveau, J.Y., Gruss, A., Delacroix-Buchet, A. (2004): Raw cow milk bacterial population shifts attributable to refrigeration. Applied and Environmental Microbiology. 70, pp. 5644-5650. https://doi.org/10.1128/AEM.70.9.5644-5650.2004

[58] Ribeiro Jr., J.C., de Oliveira, A.M., de G. Silva, F., Tamanini, R., de Oliveira, A.L.M., Beloti, V. (2018): The main spoilage-related psychrotrophic bacteria in refrigerated raw milk. Journal of Dairy Science. 101, pp. 75-83. https://doi.org/10.3168/jds.2017-13069

[59] Decimo, M., Morandi, S., Silvetti, T., Brasca, M. (2014): Characterization of gram-negative psychrotrophic bacteria isolated from Italian bulk tank milk. Journal of Food Science. 79, pp. 81-90. https://doi.org/10.1111/1750-3841.12645

[60] Baglinière, F., Salgado, R.L., Salgado, C.A., Dantas Vanetti, M.C. (2017): Biochemical characterization of an extracellular heat-stable protease from Serratia liquefaciens isolated from raw milk. Journal of Food Science. 82, pp. 952-959. https://doi.org/10.1111/1750-3841.13660